糖尿病视网膜病变(DR)作为糖尿病最为常见的并发症之一，现阶段已成为大多数患者致盲的首要原因[1]。随着糖代谢发生紊乱，引起视网膜微血管系统损伤，最终引起血管周围组织细胞凋亡、血管舒缩调节功能异常等病理改变[2]。有研究表示，DR的发生发展与体内自由基产生增加及抗氧化能力减弱有关，同时伴随机体内血液浓度水平升高，蛋白激酶B(Akt)表达降低，并出现视网膜组织细胞凋亡现象[3]。还原型谷胱甘肽(GSH)作为天然的抗氧化剂也越来越引起人们的重视，在对于参与治疗DR的研究方面也成为当前临床医学的讨论热点话题之一[4]。GSH作为人体细胞中自然合成的一种肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，广泛存在于人体各种组织细胞中，具有调节机体中蛋白质和核苷酸合成的作用，对于减少细胞内脂肪蓄积，抑制Akt蛋白和增强机体中抗氧化能力有一定作用[5]。本文主要探究GSH对DR大鼠细胞凋亡、氧化应激及Akt蛋白的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验大鼠

选取雌雄各半的健康级大鼠40只，4～6个月龄，体质量180～250 g, 由基尔顿生物科技(上海)提供，严格按照《实验动物管理条例》规定进行实验，动物许可证号：SYXK(上):2019-0045,室温控制在15～18 ℃室内饲养，湿度约为70%,每日12 h光照，喂养条件为自由摄取标准饲料，饮用干净自来水。

1.2 仪器

FEITecnai G12型透射电镜(荷兰);HMIAS2000型全自动医学彩色图像分析系统(美国Sigma公司),One-touch血糖仪(美国强生公司),显微镜(重庆光学仪器厂产XSZ-5B),切片机(上海医用仪器厂),尿糖试纸(桂林中辉科技发展有限公司),一次性无菌注射器(美国BD公司)。

1.3 试剂

0.9%生理盐水(重庆天圣制药有限公司),GSH(重庆药友制药有限公司),柠檬酸缓冲液，细胞凋亡试剂盒(上海生物工程有限公司),GSH试剂盒(南京建成生物工程研究所),链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),血清检测试剂盒(上海沪峰化工有限公司)。

1.4 DR大鼠模型建立

大鼠经裂隙灯及眼底检查均无眼部疾病，并进行适应性喂养1 w后，用随机数字法分为正常组、模型组、GSH组、Akt抑制剂组，每组10只。除正常组外，其余组大鼠禁食12 h后，50 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素，72 h后采取尾静脉血，测空腹血糖≥16.5 mmol/L,确定为糖尿病大鼠。分笼饲养4个月后监测尾静脉血糖>16.7 mmol/L的大鼠采用盐酸氯胺酮(40 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，托品卡安双眼散瞳，盐酸丙美卡因眼表面麻醉后进行眼前照相，并经尾静脉注射0.2 ml浓度为50 mg/ml的异硫氰酸葡聚糖荧光素，眼底血管造影检查眼底情况，同时具备4个月持续血糖>16.7 mmol/L且眼底血管造影出现微血管瘤及渗漏的大鼠为DR大鼠建模成功。

1.5 分组给药

正常组及模型组腹腔内注射0.1 mmol/L的柠檬酸缓冲液，GSH组每天以100 mg/kg的剂量腹腔注射GSH,Akt抑制剂组使用氯胺酮(40 mg/kg)腹腔麻醉后，经托品卡安散瞳、盐酸丙美卡因眼表面麻醉、15%磺胺醋酰钠眼液结膜囊冲洗等处理后，裂隙灯下对Akt抑制剂组用5 μl微量进样器于颞上方2点位处角膜缘后2 mm睫状环处进针，行玻璃体腔内注射10 mg/ml Akt抑制剂(MK-2206) 15 μl, 深1.0～1.5 mm, 注意不要伤及周边视网膜。大鼠自由摄食后至于相同环境饲养2 d后重复以上步骤处理一次。术后观察并排除晶状体及玻璃体损伤大鼠。

1.6 氧化应激指标检测

眼眶静脉血1 ml, 速离心机运转4 000 r/min, 10 min后取得上清液，分别采用硫代巴比妥酸法、二硫代二硝基苯甲酸法检测各组大鼠视网膜中丙二醛(MDA)、GSH水平，严格按照试剂盒说明进行检测。

1.7 血清总胆固醇(TC)、血糖、三酰甘油(TG)检测

大鼠禁食14～16 h, 抽取尾部静脉血1 ml, 5 ℃测空腹血糖，3 500 r/min离心10 min, 上清液1 ml装于1.5 ml EP管中，-20 ℃冰箱保存待测。血糖检测采用葡萄糖氧化酶法检测，TC、TG采用酶联免疫吸附试验检测，严格按照说明书标准进行测定。

1.8 组织提取

各组大鼠使用氯胺酮(40 mg/kg)腹腔麻醉，行眼球摘除，完整摘下眼球于上方12点位角巩膜缘缝线标记，至于4%多聚甲醛溶液中，置于4 ℃冰箱继续固定24 h。将视网膜组织分为两部分，一部分直接冻存-80 ℃冰箱，另一部分石蜡包埋处理并制作5 μm厚度切片。

1.9 视网膜病理组织苏木素-伊红(HE)染色

将石蜡切片烤片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱二甲苯并复水，依照试剂盒步骤进行染色，经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，用中性树胶封片。光学显微镜下对HE染色切片观察并采集图片，使用Image-Pro6.0软件分析视病理形态。

1.10 原位末端标记法(TUNEL)染色视网膜细胞凋亡

将包埋好的组织用冰冻机连续切片后，冰冻切片室温复温30 min, 使用冰丙酮固定8 min, 4 ℃磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗3次，每次5 min, 3%BSA室温封闭30 min, 滴加TUNEL反应混合液室温孵育1 h, 4 ℃PBS冲洗3次，每次5 min, 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染1 min, 4 ℃PBS冲洗3次，每次5 min, 进行封片，显微镜下观察视网膜细胞凋亡率。

1.11 Western印迹检测

取视网膜组织50 mg, 加入0.125%胰蛋白裂解液，高速离心机运转4 000 r/min, 10 min后取得上清液，血清样品中加入样孔。进行电泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜缓冲盐水(TBS)浸泡10 min, 反复PBS冲洗，5 min/次，分别加入磷酸化(p-AKT)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸甘油醛3-脱氢酶(GAPDH)抗体(1∶500)、以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G作为二抗(1∶2 000),分别杂交，PBS冲洗，后将膜浸入电化学发光(ECL)工作液，检测获取图像。

1.12 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行方差分析及t检验。

2、结果

2.1 各组视网膜氧化应激指标比较

与正常组比较，模型组、GSH组、Akt抑制剂组MDA水平升高，GSH水平降低，差异显著(P<0.05);与模型组比较，GSH组、Akt抑制剂组MDA指标显著降低，GSH水平显著升高(P<0.05);GSH组与Akt抑制剂组比较上述指标无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 各组血糖、血清TC、TG水平比较

与正常组比较，模型组、GSH组、Akt抑制剂组血糖、TC、TG水平显著升高(P<0.05);与模型组比较，GSH组、Akt抑制剂组上述指标降低，两组比较有统计学意义(P<0.05);GSH组与Akt抑制剂组比较上述指标比较无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.3 各组眼部视网膜组织细胞凋亡指数比较

与正常组比较，模型组、GSH组、Akt抑制剂组视网膜组织细胞凋亡指数升高，差异显著(P<0.05);与模型组比较，GSH组、Akt抑制剂组上述指标显著降低(P<0.05);GSH组与Akt抑制剂组视网膜组织细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1、图1。

2.4 各组视网膜Akt、PI3K蛋白表达比较

与正常组比较，模型组、GSH组、Akt抑制剂组视网膜Akt、PI3K蛋白显著升高(P<0.05);与模型组比较，GSH组、Akt抑制剂组上述指标显著降低(P<0.05);GSH组与Akt抑制剂组上述指标比较无统计学意义(P>0.05),见表1、图2。

表1 各组氧化应激指标、血糖、TC和TG水平、眼部视网膜细胞凋亡指数、Akt及PI3k蛋白表达比较

图1 各组视网膜细胞(TUNEL染色，×200)   

2.5 各组视网膜HE染色比较

正常组视网膜内、外核层细胞排列紧密、规律，表面光滑平整；模型组视网膜内界出现明显水肿，内外核层细胞排列不整齐，可见较多的血管内皮细胞突出内界膜；GSH组视网膜内界水肿明显减轻，且血管内皮细胞突出内界膜情况有所好转，内核层细胞排列疏松，血管异常情况改善。Akt抑制剂组与GSH组相似，见图3。

图2 各组Akt、PI3K蛋白表达   

图3 各组视网膜(HE染色，×400)   

3、讨论

DR前期病理改变为视网膜毛细血管周围细胞减少、基底膜增厚及视网膜屏障破坏并伴随水肿等，后期由于视网膜内血管内皮生长因子的分泌增多，引起纤维组织和新生血管加厚，最终导致眼部玻璃体组织出血或视网膜脱离等[6]。GSH作为一种抗氧化剂也是机体内重要的还原剂，存在于人体各种组织和细胞中，具有调节体内蛋白质和核苷酸合成的作用，并与机体中的抗氧化能力有关[7]。氧化应激反应增强是导致糖尿病并发症形成和发展的重要环节，高血糖状态时由于机体的抗氧化能力失衡，炎症因子过度表达，进而导致视网膜屏障破坏发生氧化应激损伤[8]。本文提示，GSH对于氧化应激水平的调控有一定影响。有研究证实，糖尿病视网膜中氧化应激增强伴着GSH水平下降，两者呈负相关[9]。GSH对于糖尿病中脂质氧化损伤的程度起到保护作用，能够有效清除机体内的超氧离子及其他自由基，有效参与葡萄糖诱导的胰岛素分泌，进而下调丙二醛(MAD)水平[10]。陆孟婷等[11]研究表示，GSH能够在糖尿病中持续活化抗氧化物质使其表达上调，进一步抑制氧化因子产生，同时防止MDA的分泌增加，以减轻视网膜炎性介质的损伤从而延缓DR发展。糖尿病的产生伴随着机体内部血糖、血清等指标的升高，在对于糖尿病及并发症的治疗中，对于血糖等因素的控制也至关重要[12]。本文表明，GSH对于DR大鼠的血糖、TC、TG等指标具有一定抑制作用。GSH通过降低血糖、血清水平，降低体内自由基，提高血清内脂蛋白酯酶和肝酯酶的活性，并通过参与调节自由基的过氧化氢酶、超氧化物等物质的活性来降低糖尿病患者体内的糖基化反应[13]。GSH通过阻断氧化和过氧化的反应来保护生物膜，降低DR患者血糖的活性表达，进而抑制视网膜神经组织紊乱而引发的视网膜功能异常情况[10]。

本文结果表明，GSH能够有效减轻DR大鼠的内膜水肿情况，改善细胞分布紊乱及内皮细胞突出问题。GSH对于保护人体由于高血糖引起的内皮细胞复制延迟，抑制细胞凋亡、促进细胞转化及维持细胞膜的完整性，参与细胞的有丝分裂、血管的生成及细胞耐性具有重要作用[14]。GSH对有多种生化功能，能够与多种化学物质及其代谢产物结合，以保护视网膜细胞膜的完整性，使内皮细胞免受其害，从而维持视网膜细胞的正常代谢功能[15]。

已有研究表明，细胞凋亡作为引起DR发生的核心机制之一，与DR有着密切的联系[16]。本文结果表明，采用GSH干预治疗，对于DR大鼠的细胞凋亡具有一定的抑制作用。GSH通过维持DR大鼠的视网膜屏障调节FasL-Fas介导内皮细胞凋亡因素，加速细胞周期的进行，促进细胞的增生，进而减少内皮细胞的损伤和凋亡[17]。有研究表示，由于细胞内葡萄糖含量增加可使糖胺合成，进而导致组织内胰岛素的抵抗，在高糖环境下导致部分神经细胞丧失，GSH可使毛细血管内皮细胞的反应性氧化物生成增多，并抑制内皮细胞的DNA合成，降低了DR早期出现的神经细胞变性、凋亡[18]。因此，GSH对于抑制DR中的眼部毛细血管内皮组织细胞凋亡有一定作用。本文结果与上述研究相似。

DR患者体内的蛋白浓度有明显增高现象[19]。本文结果表明GSH对于抑制DR大鼠的蛋白水平具有一定作用。GSH能够有效避免Akt/PI3K分子及酶分子中的有效成分发生氧化，并抑制其与有毒化合物结合，防止毒性化合物对蛋白造成的损伤，进而控制组织内炎性因子和抑制Akt/PI3K的表达。Tang等[20]研究表示，GSH通过增强糖尿病视网膜组织中血红蛋白非酶促糖基化作用的抑制强度，降低凝血因子与葡萄糖的结合，进而抑制Akt/PI3K蛋白质糖基化作用，降低视网膜组织内纤维Akt/PI3K的形成，起到稳定Akt/PI3K水平的作用。

综上所述，GSH作为抗糖尿病药物，对改善糖尿病的氧化应激和抗脂质氧化，在保护细胞膜的完整性，降低视网膜组织细胞损伤程度和蛋白表达方面具有一定作用。还可以通过抑制细胞凋亡和降低血糖浓度等指标，使内皮细胞免受其害，从而维持细胞的正常代谢以达到对视网膜的保护，为DR的发病机制及治疗方法的选择等提供了新的方向。

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基金资助:河北省卫生健康委医学科学研究项目(20210909,20220187);河北省高等学校科学技术研究项目(QN2020110);

文章来源:杨馥宇,苏杰,王玲等.还原型谷胱甘肽对DR大鼠细胞凋亡､氧化应激及Akt蛋白的作用及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(02):429-433.