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姜黄素对糖尿病小鼠肺纤维化的调控作用及机制研究

2025-01-16 83 上传者：管理员

摘要：目的探讨姜黄素(Cur)对糖尿病(DM)小鼠肺纤维化的改善作用及其机制。方法将50只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分为正常组(Con组，n=10)、姜黄素组(Cur组，n=10)、糖尿病模型组(DM组，n=12)和糖尿病姜黄素处理组(DM+Cur组，n=14)。DM组与DM+Cur组小鼠先给予高糖高脂饲料喂养4周后，小剂量腹腔注射链脲佐菌素[STZ,50mg/(kg•d)]建立糖尿病小鼠模型，1次/d,连续5d,随机血糖16.7mmol/L则为造模成功标准。造模成功后，Cur组与DM+Cur组灌胃给予Cur, 200mg/(kg•d),连续16周后处死小鼠，取肺组织，HE染色法、Masson染色及Sirius Red染色观察各组小鼠肺组织病理学改变、炎细胞浸润及胶原沉积情况；Western blot法检测各组小鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad3、p-P38MAPK、CollagenⅢ蛋白表达情况。结果与Con组相比，DM组小鼠肺组织呈明显纤维化改变，肺组织中TGF-β1、p-Smad3、p-P38MAPK、CollagenⅢ蛋白表达明显升高(P<0.01)。给予Cur处理后，DM小鼠肺组织纤维化得到明显改善，肺组织中TGF-β1、p-Smad3、p-P38MAPK、CollagenⅢ蛋白表达均有所降低(P<0.05)。结论 Cur通过降低纤维化相关蛋白CollagenⅢ的表达明显改善STZ诱导的DM小鼠肺组织纤维化，其作用机制可能与Cur抑制肺组织中TGF-β1/Smad/P38MAPK信号通路激活有关。

关键词：
大血管损伤
姜黄素
糖尿病肺纤维化
纤维化
转化生长因子-1
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糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种以高血糖、微血管和大血管损伤为主要特征的慢性代谢性疾病，长期的高血糖状态会损害多个器官和系统。肺由于其丰富的毛细血管网络，更易成为糖尿病微血管损伤的主要部位。糖尿病肺功能障碍是一种慢性、进行性、不可逆且与病程相关的肺部疾病，增加了糖尿病的死亡风险，肺纤维化是多种慢性肺疾病的主要病理特征。有研究[1]表明，高血糖诱导的系统性炎症以及刺激产生的过量活性氧(ROS)可能是糖尿病肺纤维化的重要发生因素。姜黄素(curcumin, Cur)又称异戊烯基甲烷，是姜黄根茎及其他姜黄属植物中发现的天然多酚，在酸性pH值下呈深黄色，在碱性pH值下呈红色，食品工业中常常作为着色剂和食品添加剂被广泛应用[2]。Cur具有包括抗纤维化、抗氧化、抗炎、降血脂、调节免疫等在内的多种特性，在一系列慢性疾病中都具有治疗作用[3]。我们采用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)建立糖尿病小鼠模型，观察各组小鼠形态学改变并检测TGF-β1、p-Smad3、p-P38MAPK、CollagenⅢ等蛋白在肺组织中的表达情况，探讨Cur对糖尿病小鼠肺纤维化的改善作用及其可能机制。

1、材料与方法

1.1实验动物

雄性C57BL/6小鼠，8周龄，50只，SPF级，体重252g,购自武汉大学实验动物中心，许可证号为SCXK(鄂)2014-0004。

1.2药品与试剂

Cur(sigma公司);天狼猩红染色试剂盒(武汉塞维尔公司);Masson染色试剂盒(武汉塞维尔公司);TGF-β1抗体(abclonal公司);p-Smad3(abclonal公司);p-P38MAPK抗体(abclonal公司);CollagenⅢ(abclonal公司)。

1.3实验方法

1.3.1糖尿病模型制备

将50只C57BL/6小鼠在SPF级动物房中适应性喂养1周后，随机分为正常组(n=20)和糖尿病组(n=30)。正常组以基础饲料喂养，糖尿病组小鼠以高糖高脂饲料喂养4周后，小剂量腹腔注射以柠檬酸盐缓冲液为溶剂的STZ 50mg/kg,连续5d,正常组小鼠同时给予等体积柠檬酸盐缓冲液。随机血糖16.7mmol/L表明造模成功。待血糖稳定后，从正常组小鼠中随机分出正常组(Con组，n=10)和姜黄素组(Cur组，n=10);从糖尿病组小鼠中随机分出糖尿病模型组(DM组，n=12)和糖尿病姜黄素处理组(DM+Cur组，n=14)。Cur组与DM+Cur组灌胃给予由1%羧甲基纤维素钠配制的Cur, 200mg/(kg·d),连续16周。实验期间小鼠可自由饮水进食，且无其他药物干预。

1.3.2肺组织形态学观察

实验结束后处死小鼠，取各组小鼠肺组织石蜡包埋并切片至3μm,进行脱蜡处理，按试剂盒步骤分别进行HE染色、Masson染色和Sirius Red染色。染色完毕后，使用光学显微镜对肺组织HE染色、Masson染色和Sirius Red染色切片进行观察并拍照。观察各组小鼠肺组织的病理学变化。

1.3.3 Western blot法

实验结束后处死小鼠，取出肺组织，取部分加入裂解液，待其完全裂解后，置于4℃,12 000r/min离心机中离心15min,并吸取上清液，按BCA试剂盒法测定各组样品蛋白浓度。根据测定结果，取蛋白样品，加上样缓冲液，裂解液混匀配制成相同浓度蛋白样品，并于95℃煮10min,使蛋白变性。样品充分冷却后，上样等量蛋白样品后进行电泳、转膜、脱脂牛奶封闭等步骤，经TBST漂洗后，置于4℃一抗孵育过夜。第2天取出孵育好的条带，经3次5min TBST漂洗，室温孵育二抗1h, TBST漂洗，浸泡ECL显影液，进行凝胶成像显影。

1.4统计学方法

本实验采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。计量资料以表示，各组间采用One-way ANOVA单因素方差分析进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1肺组织形态学观察

HE染色结果显示，Con组小鼠肺组织结构基本正常，未见明显病理学改变；Cur组小鼠肺组织形态与Con组一致。与Con组相比，DM组小鼠肺组织结构紊乱，肺泡壁变厚，肺泡腔部分消失，炎细胞浸润。Masson染色和Sirius Red染色结果显示，DM组小鼠肺组织纤维化改变明显，肺泡及血管周围有大量胶原纤维(Masson染色呈蓝色，Sirius Red染色呈红色)沉积。DM+Cur组小鼠肺组织结构、胶原纤维沉积、炎细胞浸润均得到明显改善。见图1。

图1 Cur对DM小鼠肺组织形态学及纤维化的影响(×400)

2.2肺组织中CollagenⅢ蛋白表达量的变化

与Con组相比，DM组小鼠肺组织中CollagenⅢ蛋白表达明显升高(P<0.01),DM+Cur组小鼠肺组织中CollagenⅢ蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 Cur对DM小鼠肺组织中CollagenⅢ蛋白表达的影响

与Con组比较，**P<0.01;与DM组比较，#P<0.05。

2.3肺组织中TGF-β1蛋白表达变化

与Con组相比，DM组小鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达明显升高(P<0.01),相较于DM组，DM+Cur组TGF-β1蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 Cur对DM小鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达的影响

与Con组比较，**P<0.01;与DM组比较，#P<0.05。

2.4肺组织中p-Smad3蛋白表达量的变化

与Con组相比，DM组小鼠肺组织中p-Smad3蛋白表达明显升高(P<0.01),相较于DM组，DM+Cur组p-Smad3蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 Cur对DM小鼠肺组织中p-Smad3蛋白表达的影响

与Con组比较，**P<0.01;与DM组比较，#P<0.05。

2.5肺组织中p-P38MAPK蛋白表达量的变化

与Con组相比，DM组小鼠肺组织中p-P38MAPK蛋白表达明显升高(P<0.01),相较于DM组，DM+Cur组p-P38MAPK蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 Cur对DM小鼠肺组织中p-P38MAPK蛋白表达的影响

与Con组比较，**P<0.01;与DM组比较，#P<0.05。

3、讨论

糖尿病是一种广泛存在的全身代谢性疾病，全球都有较高的发病率和死亡率。研究[4]表明，糖尿病患者均有不同程度的肺功能障碍，易发生各种呼吸系统疾病，肺纤维化风险也更高。糖尿病肺纤维化(diabetic pulmonary fibrosis, DPF)是糖尿病的一种肺部晚期并发症，主要是以成纤维细胞过度增殖、间质组织细胞外基质和胶原过度沉积为特征，也是糖尿病患者过早死亡的重要原因[5]。

Cur是存在于姜黄中的一种生物活性成分，具有多种有益作用。Cur可通过各种机制和分子靶点延缓糖尿病的发展，改善胰岛β细胞功能，保护胰岛β细胞，降低胰岛素抵抗[6-7]。还有有研究[8]表明，Cur可抑制博来霉素诱导的肺胶原合成、沉积和组装的变化来抑制肺纤维化的进展。在本研究中，通过HE染色、Masson染色和Sirius Red染色观察Cur对DM小鼠肺纤维化的改善作用，结果显示，DM小鼠肺组织出现明显病理改变及胶原沉积，而在Cur处理后这些表现得到明显改善。

转化生长因子-β(TGF-β)作为一种多功能细胞因子，在细胞的生长和分化过程中具有重要作用。TGF-β1可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，导致细胞外基质及胶原过度沉积，同时也抑制间质ECM的降解，从而促进肺纤维化的发生和发展。研究[7]表明，Cur可抑制TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞生物学特性的改变，减少成纤维细胞向肌成纤维细胞的增殖和分化。本研究中，Western blot结果显示，在糖尿病小鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达显著升高，而给予Cur治疗后，TGF-β1蛋白表达有所降低，表明使用Cur处理后可明显降低糖尿病小鼠肺组织中TGF-β1和p-Smad3蛋白的表达。TGF-β1与其受体复合物结合，可激活细胞内多种信号级联反应，TGF-β1虽可通过磷酸化Smad3激活Smad通路，促进α-SMA转录，使胎儿肺成纤维细胞中α-SMA蛋白表达增加，导致纤维化的发生。使用Cur处理后可明显降低糖尿病小鼠肺组织中TGF-β1和p-Smad3蛋白的表达。除了经典的TGF-β1/Smad通路外，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路被证实在肾小管纤维化模型中激活增加[9],主要包括P38、JNK等的激活。此外，研究表明，TGF-β1可诱导成纤维细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路激活，促进胶原合成[10-12]。α-SMA和CollagenⅢ均作为典型的纤维化相关蛋白，会随着纤维化严重程度的增加而增加。Yuan等[13]发现在高糖诱导的心肌纤维化大鼠模型中存在明显的CollagenⅢ沉积。同样，Xu等[14]采用PCR检测到百草枯诱导的肺纤维化大鼠模型的肺组织中，CollagenⅢ表达明显升高。

综上所述，Cur可改善DM小鼠肺功能和肺纤维化，对DM小鼠肺组织具有显著保护作用，其机制可能与Cur抑制TGF-β1/Smad/P38MAPK信号通路激活，从而降低纤维化相关蛋白CollagenⅢ的表达有关。

参考文献:

[10]周蕾,房辉,张守军,等.达格列净对糖尿病大鼠肺纤维化治疗作用机制及效果[J].中国老年学杂志,2022,42(22):5629

[11]门翔,党强,周小果,等.槲皮素对基于TGF-β1/P38 MAPK/NF-κB信号通路抗博来霉素致小鼠肺纤维化的作用及机制研究[J].中药药理与临床,2023,39(2):43

基金资助:咸宁市社发类研发重点专项(2021SFYF006);湖北科技学院糖尿病专项团队项目(2021TNB01);

文章来源:黎双炼,付晨禄,管志威,等.姜黄素对糖尿病小鼠肺纤维化的调控作用及机制研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2025,39(01):6-9.