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利拉鲁肽通过NRF2改善高糖诱导的内皮细胞损伤

2024-07-31 21 上传者：管理员

摘要：目的探讨利拉鲁肽对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的作用及机制。方法培养脐静脉内皮细胞（HUVECs），将细胞分为4组：对照组、高糖刺激组（HG组）、利拉鲁肽组、利拉鲁肽+HG组。采用ELISA法检测各组炎症细胞因子的分泌，采用试剂盒检测细胞内活性氧（ROS）的水平；采用试剂盒检测各组超氧化物歧化酶2(SOD2)和Gpx4的活性以及丙二醛（MDA）的水平；采用试剂盒检测一氧化氮（NO）含量；采用免疫印迹和免疫荧光染色法检测NRF2的核转位情况。结果 HG组细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素（IL-1）和IL-6的水平相比对照组升高；细胞内ROS的水平增加，MDA水平增加，SOD2和Gpx4的活性减少；NO的含量减少；NRF2的核转位也明显减少。与HG组的细胞相比，利拉鲁肽+HG组细胞TNF-α、IL-1、IL-6的水平降低，细胞内的ROS水平降低，MDA水平降低，SOD2和Gpx4的活性增加；NO的含量增加；NRF2的核转位也明显增加。结论利拉鲁肽通过增加NRF2的核转位抑制高糖诱导的内皮细胞损伤。

关键词：
NF-E2相关因子2
内皮细胞
利拉鲁肽
氧化应激
高血糖
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糖尿病导致的微血管内皮功能障碍是发生血管并发症的关键病理因素[1-2]。糖尿病微血管疾病主要表现为视网膜病变、肾病、神经病变、心血管病变和下肢异常，分别导致视力障碍、肾衰竭、中风、糖尿病性心肌病和下肢功能障碍[3-4]。目前尚无针对糖尿病微血管病变的特异性治疗方法，因此探寻靶向治疗糖尿病内皮损伤的新方法迫在眉睫。

胰高血糖素样肽1(GLP-1）是肠道L细胞产生和释放的肠促胰岛素激素，其可以作用于胰岛细胞刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌[5]。GLP-1激动剂目前已在临床上用于2型糖尿病的治疗[6]。GLP-1及其类似物也被研究[7-10]证实可以发挥心脏保护作用。GLP-1受体激动剂利拉鲁肽减少实验小鼠心肌梗死面积，保护心肌细胞[11]。利拉鲁肽还可以减轻压力负荷诱导的心肌纤维化[12-13]，然而利拉鲁肽是否直接作用于内皮细胞，保护内皮细胞的功能，鲜见研究报道。本研究旨在探讨利拉鲁肽对高糖刺激下内皮损伤的保护作用及机制。

1、材料与方法

1.1细胞处理

HUVEC购自上海中科院细胞典藏中心，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。对照组：细胞转染空载体Sc RNA,12 h后给予正常糖（5.5 mmol/L）、27.5 mmol/L的甘露醇处理48 h（模拟高糖刺激下的高渗状态）；高糖组（HG组）：细胞转染空载体Sc RNA,12 h后给予高糖（33.5 mmol/L）处理48 h；利拉鲁肽组：细胞给予利拉鲁肽（100 nmo/L），同时高渗处理48 h；利拉鲁肽+HG组：细胞给予利拉鲁肽（100 nmo/L）同时给予高糖处理48 h。

1.2 HUVEC细胞中促炎因子水平的检测

采用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1、IL-6的水平。细胞处理后，每孔加入50μL裂解液，在冰上裂解15 min，随后采用细胞刮刀收集细胞，在-4℃后离心1 200 r/min 30 min，收集上清液。采用ELISA试剂盒根据说明书检测各组炎症因子的水平，绘制标准曲线，采用酶标仪检测各组吸光度，计算炎症因子浓度。

1.3 HUVEC中氧化应激因子水平的检测

采用荧光探针DCFH-DA进行活性氧（ROS）检测。处理后的细胞每孔加入10μL稀释后的DCFH-DA荧光探针，避光孵育30 min，培养基洗涤3次后在酶标仪下检测450 nm处的激发光强度。采用试剂盒检测MDA的含量，SOD2和Gpx4的活性。细胞分组处理后每孔加入50μL裂解液，细胞接种于6孔板，每孔接种1×106个细胞，在冰上裂解15 min，随后采用细胞刮刀收集细胞，在-4℃后离心1 200 r/min 30 min，收集上清液，检测蛋白浓度后，采用相应试剂盒检测酶活性，在酶标仪下检测各指标吸光度。

1.4 HUVEC细胞活性检测

细胞分组处理后每孔加入10μL CCK-8溶液，在室温下孵育30 min，采用PBS洗涤3次后，在酶标仪下检测各组450 nm处的光密度值（OD值）。细胞增殖率=（OD处理-OD对照）/OD对照×100%。

1.5 NRF2免疫荧光染色

细胞分组处理后，采用40 g/L多聚甲醛固定5 min，采用Tritol X-100进行通透10 min，采用8%羊血清封闭1 h，采用抗NRF2一抗（1∶100稀释）孵育过夜，第二天复温后采用488荧光二抗孵育细胞1 h，采用DAPI进行细胞核染色封片，在显微镜下观察。

1.6统计学方法

所有细胞实验独立重复3次，采用SPSS 23.0分析数据。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验分析两两比较，采用单因素方差分析进行多组间比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1利拉鲁肽对高糖刺激下HUVEC炎症因子水平的影响

ELISA结果显示，与对照组相比，HG组细胞促炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6的水平显著升高（P<0.05）；利拉鲁肽+HG组细胞促炎症因子水平显著低于HG组（P<0.05）。见表1。

表1 4组细胞中炎症因子水平的比较

2.2利拉鲁肽对高糖刺激下HUVEC氧化应激的影响

HG组细胞ROS和MDA水平显著高于对照组（P<0.05），抗氧化酶SOD2和Gpx4活性明显低于对照组（P<0.05）；利拉鲁肽+HG组细胞ROS和MDA水平明显低于HG组（P<0.05);SOD2和Gpx4活性明显高于HG组（P<0.05）。见表2。

2.3利拉鲁肽对高糖刺激下细胞活性的影响

采用CCK-8试剂盒检测细胞活性，结果发现：HG组细胞活性明显低于对照组（P<0.05）；利拉鲁肽+HG组细胞活性明显高于HG组（P<0.05）。见表3。

2.4利拉鲁肽对高糖刺激下细胞NO水平的影响

采用NO试剂盒检测细胞NO水平，结果发现：HG组细胞NO水平明显低于对照组（P<0.05）；利拉鲁肽+HG组细胞NO水平明显高于HG组（P<0.05），见表3。

表2利拉鲁肽减轻HG诱导的氧化应激反应

表3细胞活性、NO及NRF2核转位水平比较

2.5利拉鲁肽对内皮细胞NRF2表达以及核转位的影响

NRF2染色结果显示：HG组细胞NRF2表达以及核转位水平低于对照组；利拉鲁肽+HG组细胞NRF2表达以及核转位水平高于HG组。利拉鲁肽能使高糖刺激下的NRF2核转位细胞比增加（图1-2和表3-4）。

图1各组细胞NRF2表达及核转位水平（放大倍数200×，标尺：100μm)

3、讨论

血管内皮功能障碍是导致糖尿病血管并发症的主要机制之一[14-17]。目前并未找到预防甚至治疗糖尿病血管并发症的有效治疗办法。利拉鲁肽是一类GLP-1类似物[18-19]。以往的研究发现利拉鲁肽改善肝脏代谢和心肌纤维化，防治心肌损伤[6-7,12]。但是利拉鲁肽对内皮细胞是否具有保护作用少见报道。本研究发现利拉鲁肽可以直接作用于内皮细胞，抑制高糖刺激下内皮细胞在病理状态下的炎症和氧化应激。提示利拉鲁肽可能作为预防或者治疗糖尿病血管并发症的有效措施。

心血管内皮动脉粥样硬化是糖尿病血管并发症的初始病理改变，一氧化氮（NO）生成紊乱和代谢紊乱在内皮损伤中起触发作用[20]。内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表达减少导致NO合成减少，这种病理改变打破了血管氧化还原平衡，是动脉粥样硬化的早期特征[21-22]。e NOS来源的NO对维持血管稳态必不可少，后者抑制血小板聚集，减少平滑肌细胞增殖和迁移[23]。以往的研究[12]报道利拉鲁肽可以调控心肌细胞内的能量代谢通路AMPKα和m TOR信号通路，但是利拉鲁肽在内皮细胞中的调控机制少见报道。本研究发现利拉鲁肽可以增加内皮细胞中NO的含量，从而减少内皮细胞在高糖刺激下的损伤反应。

图2各组细胞NRF2细胞浆表达及核表达水平

表4细胞浆、细胞核NRF2表达水平比较

NRF2是一种调节细胞氧化应激反应的关键转录因子。在正常生理条件下，NRF2与Kelch样表氯醇相关蛋白（Keap1）结合形成复合物[20,24]。这些复合物被肌动蛋白锚定在细胞质中，处于低活性状态。在氧化应激或其他病理刺激下，Keap1的半胱氨酸残基被修饰以诱导NRF2的磷酸化，NRF2从复合物中释放并转运到细胞核，调节下游基因的表达；激活一系列抗氧化酶的表达；并促进抗氧化应激、抗炎、抗凋亡和其他细胞保护机制[25]。以往研究发现利拉鲁肽可以激活NRF2保护内皮祖细胞的功能。本研究采用脐静脉内皮细胞系，发现利拉鲁肽可以增加内皮细胞中NRF2的核转位水平，从而增加内皮细胞SOD2、Gpx4等抗氧化酶的表达，减少细胞氧化应激损伤。

本研究采用脐静脉内皮细胞系，在体外验证了利拉鲁肽对内皮细胞的保护作用，后续研究可采用心脏微血管原代内皮细胞进一步探讨利拉鲁肽对心脏微血管的保护作用；此外，本研究尚未进行动物实验验证利拉鲁肽在体心血管的保护作用，后续研究可采用小鼠糖尿病模型进一步探讨利拉鲁肽对心血管的保护作用。

综上所述，利拉鲁肽可以保护高糖刺激下的内皮细胞，减少内皮细胞炎症、氧化应激，减少细胞死亡。利拉鲁肽通过增加内皮细胞中NO的含量，增加内皮细胞中NRF2的核转位发挥上述作用。

参考文献:

[15]石建梅,王茜茜,韦晓洁.铁蛋白自噬在糖尿病及其相关并发症发病机制中的研究进展[J].实用医学杂志,2024, 40(3):417-422.

[18]林丹红,全会标,欧倩滢,等.利拉鲁肽对超重或肥胖男性2型糖尿病患者睾酮及性功能的影响[J].实用医学杂志,2023,39(7):894-898.

[19]任丽君,高红红,宋瑞捧.胰高血糖素样肽1受体基因遗传变异对利拉鲁肽治疗2型糖尿病患者疗效的影响[J].实用医学杂志,2023, 39(2):164-169.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:81970201);河南省优秀青年科学基金资助项目(编号:212300410076);

文章来源:孙云龙,孟哲,王喜甲,等.利拉鲁肽通过NRF2改善高糖诱导的内皮细胞损伤[J].实用医学杂志,2024,40(15):2051-2055.