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Hib荚膜多糖在疫苗制备周期中的结构稳定性

2024-02-22 374 上传者：管理员

摘要：目的评价b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b,Hib）荚膜多糖的基本结构聚核糖基核糖醇磷酸酯（polyribosylribitol phosphate,PRP）在Hib结合疫苗制备过程中的稳定性。方法采用核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）技术对制备的Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物进行结构解析。结果制备的Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物的各项检测结果均符合《中国药典》三部（2020版）相关标准要求，且NMR谱图均未发生明显变化。结论 Hib结合疫苗主要抗原荚膜多糖的基本结构PRP在疫苗制备周期中未发生变化。

关键词：
b型流感嗜血杆菌
儿童侵袭性细菌感染
核磁共振波谱法
聚核糖基核糖醇磷酸酯
荚膜多糖
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b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b,Hib）是引起儿童侵袭性细菌感染的主要原因之一[1]。儿童感染后会引起脑膜炎、肺炎、败血症、化脓性关节炎、骨髓炎、心包炎、蜂窝织炎、会厌炎等疾病[2,3]。Hib的主要毒力因子为荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS），其基本单元为聚核糖基核糖醇磷酸酯（polyribosylribitol phosphate,PRP），具有较好的免疫原性，能在人体中诱导产生保护性抗体[4,5]。预防和控制Hib传染病的有效措施是接种Hib疫苗[6,7]。由于多糖疫苗不能引发T细胞依赖型免疫反应，在婴幼儿中保护效果较差，现已被结合疫苗取代[8,9]。Hib结合疫苗是将多糖PRP与载体蛋白通过共价键连接，使其由非T细胞依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而激发细胞免疫，产生免疫记忆[7,10,11]。Hib荚膜多糖PRP重复单元的结构见图1[12]。

图1 Hib荚膜多糖PRP重复单元结构图

核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）技术是研究原子核对射频辐射的吸收，类似红外或紫外光谱，在适当的磁场条件下，样品能够吸收射频区的电辐射，而且所吸收的辐射频率取决于样品特性，用吸收峰频率对吸收峰强度绘图构成NMR谱图[13]。NMR是对各种有机物、无机物的成分或结构进行定性或定量分析的最有效工具之一，其在分析化学、生命科学、材料检测等领域广泛应用[14,15,16,17,18]。特别是2D NMR的出现和发展，使NMR成为糖类物质结构解析的主要工具[19]。

结构是多糖活性的基础，不同化学结构的多糖具有不同的生物活性，解析多糖的结构是揭示其构效关系的关键环节[20,21]。Hib结合疫苗制备过程中存在剧烈的化学反应。为探讨Hib结合疫苗制备过程中PRP的结构变化情况，本研究采用1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR及1H-1H COSY、1H-13C HSQC等2D-NMR技术，探讨Hib PRP在疫苗制备周期中的结构变化，以期评价Hib PRP在疫苗制备周期中的稳定性。

1、材料与方法

1.1菌株

Hib菌种源自常州市第二人民医院3月龄重症肺炎患儿，编号：MH200201[22]。本研究获得江南大学医学伦理委员会批准（JNU20020104IRB09）。

1.2主要试剂及仪器

胰蛋白胨购自美国ThermoFisher公司；酵母浸出粉购自德国MERCK公司；破伤风类毒素购自北京民海生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵购自美国VWR Chemicals LLC；酪蛋白胨、氯化血红素、辅酶、溴化氰、己二酰肼（ADH）、碳二亚胺、乙腈购自美国SIGMA-ALDRICH公司；Se-pharose 4 Fast Flow购自美国Cytiva公司；600 L发酵罐购自上海高机生物工程有限公司；pH计购自瑞士梅特勒托利多；层析系统购自美国GE公司；400 MHz核磁共振谱仪和DRX 600 MHz核磁共振波谱仪购自德国Bruker公司。

1.3 Hib精制多糖的制备

将Hib菌种于35～38℃条件下培养14～20 h，传2代后，于36～38℃条件下培养2～5 h，再传2代，按A550为0.05～0.3时的接种密度接种至600 L发酵罐，控制p H为7～7.2、温度为36～38℃，进行发酵培养，并适时补充500 g/L葡糖糖，6 h后停止发酵，加入1%甲醛溶液灭活。将灭活的发酵液（12 000～20 000）×g连续流去菌体后，采用十六烷基三甲基溴化铵沉淀收集复合多糖，再经乙醇、丙酮、苯酚进一步提取，得到Hib精制多糖。试验重复2次。获得3批（34-20011001、34-20011002、34-20031003)Hib精制多糖。按照《中国药典》三部（2020版）[23]要求进行相关检测。

1.4 Hib多糖衍生物的制备

参考尹珊珊[24]方法，使用氯化钠溶液分别溶解34-20011001、34-20011002、34-20031003批Hib精制多糖，并调节p H至10～11，按照（0.5～1.0)mg溴化氰/mg多糖的比例，加入溴化氰溶液，活化多糖；多糖活化后，再次调节p H至8.5～9.5，按照3.5 mg ADH/mg多糖的比例，加入ADH溶液衍生多糖，使ADH与多糖共价连接；用氯化钠溶液从衍生后多糖溶液中置换出残留溴化氰、ADH等杂质，获得Hib多糖衍生物。试验重复2次。获得3批（34-20123038、34-20123041、34-20123044)Hib多糖衍生物。按照《中国药典》三部（2020版）[23]要求进行相关检测。

1.5 Hib多糖蛋白结合物的制备

将Hib多糖衍生物的p H调节至5.7±0.3，参考孙晓东等[22]方法，按照破伤风类毒素∶多糖质量比为0.8∶1～1∶1，向多糖衍生物中加入破伤风类毒素。同时向上述反应体系中加入碳二亚胺至终浓度为20～60 mg/m L，并维持p H为5.8±0.3，于2～8℃反应2～6 h，以便破伤风类毒素通过ADH与多糖共价连接；结合物经氯化钠溶液透析后，用Sepharose 4 Fast Flow层析柱纯化，流动相为氯化钠溶液，监测波长为280 nm，收集V0附近洗脱液，获得Hib多糖蛋白结合物。试验重复2次。获得3批（34-20123038、34-20123041、34-20123044)Hib多糖蛋白结合物，按照《中国药典》三部（2020版）[23]要求进行相关检测。

1.6核磁方法

参考QIN等[16]方法进行1H-NMR、31P-NMR扫描；13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC、HMBC的参数设置见表1。

表1 NMR参数设置

2、结果

2.1 Hib精制多糖的鉴定Hib精制多糖的各项检查结果均符合标准要求，且3批精制多糖检测结果基本一致，见表2。表明Hib精制多糖的制备工艺稳定性良好。

3批Hib精制多糖的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR谱图具有良好的一致性，见图2。表明3批Hib精制多糖品质良好且稳定，精制多糖制备工艺稳定。

3批精制多糖的NMR谱图均具有良好的一致性，因此选择34-20011001批精制多糖作为研究对象，其1H-NMR报告：δ=5.04、4.59、4.23、4.16、4.16、4.08、3.99～3.90、3.88～3.82、3.75、3.73～3.64、3.61、2.20、1.15 ppm,13C-NMR报告：δ=106.64、81.90、74.25、73.70、73.67、71.33、70.88、70.05、68.55、66.68、62.26、57.41、16.79 ppm,31P-NMR报告：δ=0.17 ppm。根据PRP的化学结构结合Hib精制多糖的1H-13C HSQC、1H-1H COSY谱图分析，可知1H-NMR中3.61 ppm附近为乙醇的亚甲基（-CH2）中H信号，2.20 ppm附近为丙酮的甲基（-CH3）中H信号，1.15 ppm附近为乙醇的甲基（-CH3）中H信号，其余均为Hib荚膜多糖相关H信号；13C-NMR图谱中57.41 ppm附近为乙醇的亚甲基（-CH2）中C信号，16.79 ppm附近为乙醇的甲基（-CH3）中C信号，其余均为Hib荚膜多糖相关C信号；31P-NMR在0.17 ppm附近有磷酸酯中P信号。在1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR、1H-13C HSQC、1H-1H COSY谱图中，将每个峰进行归属。见图3。

图2 3批Hib精制多糖的NMR谱图

表2 Hib精制多糖鉴定结果

图3 Hib荚膜多糖的NMR谱图

2.2 Hib多糖衍生物的鉴定

Hib多糖衍生物各项检测结果均符合标准要求，且3批多糖衍生物检测结果一致，见表3。表明Hib多糖衍生物的制备工艺稳定性良好。

3批Hib多糖衍生物的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR谱图具有良好的一致性，见图4。表明3批Hib多糖衍生物品质良好且稳定，多糖衍生物的制备工艺稳定。

表3多糖衍生物的鉴定结果

图4 3批Hib多糖衍生物的NMR谱图

3批Hib多糖衍生物的NMR谱图均具有良好的一致性，因此选择34-20123038批多糖衍生物作为研究对象，在其1H-NMR谱图1.60、2.26 ppm附近，发现与ADH相关的H信号；在13C-NMR谱图24.5、33.28、175.3 ppm附近，发现ADH的C信号；同时在1H-13C HSQC、1H-1H COSY、HMBC谱图中，均发现了与ADH相关的信号。见图5。表明Hib多糖衍生物已连接ADH。

2.3 Hib多糖蛋白结合物的鉴定

Hib多糖蛋白结合物各项检测结果均符合标准要求，且3批多糖蛋白结合物检测结果一致，见表4。表明Hib多糖蛋白结合物的制备工艺稳定性良好。

图5 Hib多糖衍生物的NMR谱图

3批Hib多糖蛋白结合物的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR谱图具有良好的一致性，见图6。表明3批Hib多糖蛋白结合物品质良好且稳定，多糖蛋白结合物的制备工艺稳定。

3批Hib多糖蛋白结合物NMR谱图均具有良好的一致性，因此选择34-20123038批多糖蛋白结合物作为研究对象，在其1H-NMR谱图0.75～3.0 ppm处，有相应H信号，有别于Hib精制多糖和多糖衍生物1H-NMR谱图，推测为ADH和蛋白质上的相关H信号；在13C-NMR谱图24.5、33.28、175.3 ppm附近，ADH相关C信号不明显，可能是连接上载体蛋白后，ADH相对含量较低导致未能体现在谱图中；同时在1H-13C HSQC、1H-1H COSY谱图，发现与Hib精制多糖相似的信号，表明Hib多糖已连接上了蛋白质。见图7。

图6 3批Hib多糖蛋白结合物NMR谱图

2.4 PRP结构的变化情况

为探讨PRP在疫苗制备全生命周期中结构的变化情况，将Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR谱图分别进行叠加对比，可以看出除乙醇、丙酮、ADH相关信号峰的差异外，与PRP结构相关的信号峰基本一致，见图8。表明PRP结构在Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物中的谱图均未发生明显变化。

表4多糖蛋白结合物的鉴定结果

图7 Hib多糖蛋白结合物的NMR谱图

图8 Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物的谱图对比图

3、讨论

Hib荚膜多糖是由多个聚核糖基核糖醇磷酸酯重复单元组成，是Hib结合疫苗中的免疫原[25]。结构是多糖活性的基础[26]，研究多糖结构的变化情况有重要意义。Hib结合疫苗制备过程中Hib荚膜多糖经过化学反应（活化、衍生），再与载体蛋白进行偶联，该过程中涉及剧烈的化学反应，Hib PRP的结构是否发生变化是值得探讨的问题。本研究依托Hib PRP的基本结构，利用核磁谱图进行解析，在1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR谱图中，将Hib PRP基本单元中的H、C、P一一归属，并与已报道的Hib多糖1H-NMR谱图[27]经对比基本一致。Hib荚膜多糖的1H-NMR、13C-NMR谱图中具有乙醇和丙酮相关信号，表明Hib精制多糖中残留一定的乙醇和丙酮，但在Hib多糖衍生物和多糖蛋白结合物的1H-NMR、13C-NMR谱图中并未发现与乙醇和丙酮相关信号，表明后续工艺可显著降低乙醇和丙酮的残留水平。Hib多糖衍生物的1H-NMR、13C-NMR谱图可明显看出ADH相关信号，表明已将ADH连接至Hib多糖上。而Hib多糖蛋白结合物1H-NMR谱图中的0.75～3.0 ppm处具有与蛋白相关的H信号，但不能清晰归属；13C-NMR谱图ADH相关信号峰也未能在谱图中很好体现，均与Hib多糖衍生物连接上蛋白载体后，导致多糖和ADH相对浓度较低相关。

本研究通过NMR技术研究Hib荚膜多糖、多糖衍生物、结合物的结构，结果显示，Hib荚膜多糖到多糖衍生物再到结合物，其基本结构并未发生变化，表明作为Hib结合疫苗主要抗原的PRP结构，在疫苗制备的全生命周期内，具有良好的稳定性，即Hib结合疫苗主要抗原基本结构在疫苗制备周期内具有良好的稳定性。

参考文献:

[12]张延龄,张晖.疫苗学[M].北京:科学出版社,2004:890.

[13]西尔弗斯坦(美),韦伯斯特(美),基姆勒(美).有机化合物的波谱解析[M].上海:华东理工大学出版社,2007:131.

[22]孙晓东,佟巍,李绍军,等.冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的初步研究[J].国际生物制品学杂志,2014(3):110-113.

[23]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2020:95-97.

[24]尹珊珊.Hib PRP-TT结合疫苗的制备及其免疫原性研究[D].延吉:延边大学,2009.

基金资助:国家科技重大专项(2015ZX09108005);

文章来源:张腾腾,秦春君,尹珊珊等.Hib荚膜多糖在疫苗制备周期中的结构稳定性[J].中国生物制品学杂志,2024,37(02):129-137.