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儿童尿路感染大肠埃希菌耐药性特点及黏附素基因表达研究

2024-10-02 119 上传者：管理员

摘要：目的探讨儿童尿路感染大肠埃希菌耐药性特点及黏附素基因表达。方法选择2019年10月1日-2022年10月1日首都医科大学附属北京儿童医院保定医院尿液样本分离的非重复感染大肠埃希菌160株，并进行药敏试验。根据药敏试验结果分为敏感组（n=80）和耐药组（n=80）。PCR检测fimH、fimA、fimB、papA、papB、papC、papGII基因，实时荧光定量PCR方法检测相对表达量，酵母细胞黏附试验和红细胞凝集试验检测I型菌毛及P型菌毛的黏附能力。结果敏感组对氨苄西林、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、左氧氟沙星的耐药率>10%，对环丙沙星、头孢唑林、妥布霉素和氨曲南的耐药率<10%，对其他抗生素则完全敏感；耐药组对头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南耐药率≤4%，对其他抗生素的耐药率均>50%。耐药组P型菌毛papGII基因检出率（40.00%）显著高于敏感组（15.00%），差异有统计学意义（χ2=12.541,P<0.05）；两组papA、papB和papC基因检出率差异均无统计学意义（P均>0.05）。敏感组fimH、fimB、papB、papC和papGII基因表达量高于耐药组，差异均有统计学意义（t=20.575、33.727、3.095、19.461、4.275,P均<0.05）；两组fimA、papA基因表达量比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。敏感组菌株I型菌毛的黏附率高于耐药组，差异有统计学意义（χ2=13.231,P<0.05）。结论耐药组I型菌毛的黏附能力下降与菌株的适应性代价有关，fim及pap基因簇编码的其他基因的转录和缺失可能对I型菌毛及P型菌毛的黏附功能产生影响。

关键词：
儿童
大肠埃希菌
尿路感染
耐药性
黏附素基因
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尿路感染（urinary tract infections,UTIs）是指泌尿系统不同部位的感染和炎症，尤其是膀胱、输尿管、尿道和肾脏，常见于儿童尤其是婴幼儿[1]。尿路致病性大肠埃希菌（uropathogenic Escherichia coli,UPEC）是UTIs最常见的致病菌，该菌携带多种假定毒力因子，如黏附素基因包括Ⅰ型菌毛fim H、fim A、fim B基因和P型菌毛pap A、pap B、pap C、pap GII基因[2]。大肠埃希菌产生促进生物被膜形成的黏附因子，可用于保护细菌免受宿主的免疫反应和抗菌治疗[3]。大肠埃希菌黏附因子可形成生物被膜，增加大肠埃希菌对抗生素治疗的耐药性[4]。菌毛在大肠埃希菌引起的UTIs中起着至关重要的作用。抗生素是UTIs的常规治疗手段，常规使用抗生素会产生可持续长达6个月的耐药微生物菌株，大多数分离株对不同类型的抗生素，特别是氟喹诺酮类、四环素类、青霉素类、大环内酯类、头孢菌素类和氨基糖苷类具有显著的耐药性，导致大多数治疗方案失败，引起住院时间和治疗费用的增加[5-6]。本研究旨在探讨儿童尿路感染大肠埃希菌耐药性特点及黏附素基因表达研究，现报告如下。

1、对象与方法

1.1标本来源

选择2019年10月1日-2022年10月1日于首都医科大学附属北京儿童医院保定医院治疗尿液样本分离的非重复感染大肠埃希菌160株，其中男73例，女87例，年龄6个月～3岁。根据药敏试验结果分为敏感组（n=80）和耐药组（n=80）。尿液标本采集根据《全国临床检验操作规程（第4版）》检验送检标本[7]，确保遵循正确的操作规范。

1.2大肠埃希菌鉴定

尿液标本在血琼脂平板（BA）、中国蓝琼脂平板（CBAP）（安图生物）上培养，37℃培养24 h。大肠埃希菌分离株通过革兰氏染色和生化试验进行鉴定。将分离出的菌株进行菌落形态学，革兰氏染色，并使用VITEK2 compact自动微生物鉴定系统进行鉴定，步骤如下：(1)准备菌株的培养物，并按照VITEK2 compact系统的操作说明进行操作；(2)将培养物放入系统提供的载玻片中，并按照系统要求的程序启动鉴定程序；(3)系统将自动进行菌种鉴定，并生成相应的鉴定报告。

1.3药敏试验

根据2016年版美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准[8]，药敏结果按敏感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。耐药菌株为多重耐药菌，多重耐药菌株通常被定义为对3种或3种以上抗生素同时耐药。由上海市临床实验室中心提供质量控制菌株：大肠埃希菌ATCC25922，质量控制菌株与临床标本按照标准方法进行检测。

1.4 DNA提取及PCR

将鉴定正确的大肠埃希菌分离株在营养琼脂平板上划线，36℃培养24 h。从营养琼脂上挑取单个明显的菌落，转移到50 m L营养肉汤中，在37℃、180 r/min的旋转摇床上培养9 h。然后，将悬浮液转移到灭菌的1.5 m L Eppendorf管中，用于DNA提取。根据制造商说明书进行DNA提取，于-20℃保存，待测。PCR反应在PE 9600实时荧光定量PCR系统中进行。反应体系：10 Taq DNA多聚酶缓冲液5.0μL,d NTPs 4.0μL,PCR引物（20 mmol/L)0.5μL,Taq DNA多聚酶0.4μL，无核酸酶水3.1μL,DNA模板2.0μL。PCR引物见表1。

表1大肠埃希菌黏附素相关基因PCR扩增引物

1.5相对定量检测

使用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取总RNA。以16S r RNA作为内参。使用One Step TB Prime Script RT-PCR Kit II(Ta Ka Ra，北京，中国）和ABI 7500（美国应用生物系统公司，美国）分析m RNA表达量。反应条件为：42℃5 min;95℃10 s,60℃30 s,40个循环。实时数据采用2-△△Ct法计算。引物序列见表2。

表2大肠埃希菌黏附素相关基因实时荧光定量PCR扩增引物

1.6黏附试验与凝集试验

黏附试验：（1）挑取单个菌落将其转移到LB肉汤培养液中，然后在37℃下过夜培养。将培养好的菌液经磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤，以去除培养液中的残留物和其他污染物。（2）将洗涤后的菌液与1%酵母细胞混合（可使菌液与酵母细胞接触并进行黏附试验）；（3）将洗涤后的菌液与1%酵母细胞和2%甘露糖同时混合（观察甘露糖是否能抑制菌液与酵母细胞的凝集现象）；（4）培养和观察：将混合后的菌液在37℃下进行培养一段时间后，使用高倍镜观察是否出现菌液与酵母细胞的凝集现象（若出现凝集且甘露糖能抑制凝集，则可判断为黏附试验阳性）；（5）使用CFT073菌株做阳性对照，重复试验3次，用于评估I型菌毛的黏附能力，并通过观察是否出现凝集以及甘露糖对凝集的抑制情况来判断黏附试验阳性。

凝集试验：（1）将PBS洗涤红细胞（洗涤3次）制备好；（2）从洗涤好的红细胞悬浮液中取出10μL，然后将其放置在载玻片上（可以使红细胞均匀分布在载玻片上）；（3）从培养基中选择一个单独的菌落，并将其涂抹在载玻片上的红细胞上（可使菌落与红细胞接触并进行黏附试验）；（4）轻轻地混合菌落和红细胞，然后观察是否出现凝集现象（凝集现象表明菌落具有P型菌毛的黏附能力）；（5）如果出现凝集现象，则可以进一步确认是否为血凝阳性菌株。将D甘露糖添加到试验中，如果菌落的黏附能力不受D甘露糖抑制，则可以确认为血凝阳性菌株。这个实验步骤可以用于评估P型菌毛的黏附能力，并且可以通过使用D甘露糖来确认血凝阳性菌株。

1.7统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，采用成组t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1敏感组和耐药组对常用抗生素的耐药性

敏感组UPEC对氨苄西林、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、左氧氟沙星的耐药率>10%，对环丙沙星、头孢唑林、妥布霉素和氨曲南的耐药率<10%，对其他抗生素则完全敏感；耐药组UPEC对头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南耐药率≤4%，对其他抗生素的耐药率均>50%，见表3。

表3敏感组与耐药组大肠埃希菌对常用抗生素的耐药性

2.2黏附素基因在大肠埃希菌分离株中的分布

耐药组P型菌毛pap GII基因检出率（40.00%）显著高于敏感组（15.00%），差异有统计学意义（χ2=12.541,P<0.05）；两组pap A、pap B和pap C基因检出率差异均无统计学意义（P均>0.05），见表4。

表4敏感组和耐药组大肠埃希菌黏附素基因检出情况

2.3敏感组和耐药组大肠埃希菌黏附素基因m RNA相对表达水平

敏感组fim H、fim B、pap B、pap C和pap GII基因表达量高于耐药组，差异均有统计学意义（t=20.575、33.727、3.095、19.461、4.275,P均<0.05）；两组fim A、pap A基因表达量比较差异均无统学意义（P均>0.05），见表5。

2.4黏附特性

敏感组菌株Ⅰ型菌毛的黏附率高于耐药组，差异有统计学意义（P<0.05），见表6。

表5敏感组和耐药组大肠埃希菌黏附素基因m RNA相对表达水平（±s)

表6敏感组和耐药组大肠埃希菌中I型和P型菌毛的黏附情况

3、讨论

尿路感染是儿科常见的感染性疾病之一，5.6%～10.2%的患儿会出现永久性肾瘢痕，导致早期高血压、复发性肾盂肾炎、肾脏发育不良、肾小球功能受损、终末期肾病等严重并发症，由于临床表现不典型，常难以得到及时有效的治疗[9]。UPEC是UTIs的主要致病菌，本研究报道了尿路感染患儿大肠埃希菌耐药性和黏附素基因表达情况。

无论在儿科住院患者还是门诊患儿中，大肠埃希菌均是引起UTIs的主要病原菌[10]。粘附和定植是UTIs发病机制中的关键步骤。大肠埃希菌通常通过各种粘附素来识别尿上皮细胞并介导定植[11]。Ⅰ型菌毛主要由蛋白质fim A组成，这种蛋白质与辅助蛋白fim F、fim G和粘附素fim H有关，均由膜基因簇编码[12]。P型菌毛由pap基因簇编码，包含11个基因。P型菌毛促进小管内壁上皮细胞的早期定殖，而Ⅰ型菌毛似乎在细菌间结合和生物膜形成中起作用[13]。Ⅰ型菌毛和P型菌毛的表达能够促进大肠埃希菌对宿主细胞的黏附和侵袭[14]。Ⅰ型菌毛在细菌黏附和侵袭膀胱上皮细胞中起重要作用，当发生尿路感染时，UPEC通过Ⅰ型菌毛黏附于尿路上皮细胞，与尿路上皮细胞整合素和尿路斑块蛋白类受体结合，使大肠埃希菌侵入并定植于膀胱，形成细胞内细菌群落[15]。大肠埃希菌感染的严重程度取决于某些假定的毒力因子的存在和活性，fim和pap G是菌毛尖端的黏附素，介导大肠埃希菌对宿主细胞的粘附和侵袭，降低fim和pap G的表达可直接减少细菌对宿主细胞的粘附和侵袭[16]。fim粘附介导大肠埃希菌对膀胱上皮的粘附以及膀胱上皮细胞和肥大细胞侵入小泡，据报道这可以保护细菌免受宿主防御和抗菌剂的侵袭[17]。在免疫功能下降、癌症或膀胱感染等因素干扰尿道组织时，fim可能就会发挥作用，引起尿路感染。临床上，Ⅱ类pap G等位基因主要与人类肾盂肾炎相关，pap GII为长尾纤毛，pap GII表达已被证明与尿路感染的致病性有关[18]。

本研究发现，pap GII基因在耐药组中检出率较高，这可能意味着pap GII基因在UPEC的耐药过程中起着一定的作用。关于UPEC中fim H、fim B和pap B基因检出率较高（均>50%），与国外相关报道结果相符[19]，这也说明这些基因在UPEC的普遍存在性。这些基因可能在UPEC菌株的早期演化中就存在，也有可能是随着时间的推移和长期的进化过程而发展起来的。

本研究中，敏感组菌株Ⅰ型菌毛的黏附功能高于耐药组，这可能与菌株的适应性代价有关。适应性代价是指细菌在适应一种环境条件或产生一种特定特征时所付出的生物学成本。在细菌中，耐药性通常是通过突变或水平基因转移等机制获得的，但这些获得耐药性的变化可能会对其他生物学特征产生影响。在这种情况下，推测敏感组菌株的Ⅰ型菌毛黏附功能较高可能是因为耐药组菌株在获得耐药性的同时，对黏附功能进行了调整。这种调整可能是通过突变或基因调控等方式实现的，但同时也导致了黏附功能的降低。因此，敏感组菌株在适应性代价较低的情况下可能保留了较高水平的黏附能力。本研究发现，fim H及fim B基因在敏感组中的表达率较高，这表明敏感组菌株在转录水平上具有更高的fim H和fim B基因表达，与其黏附水平的表现相符合。fim基因簇是编码Ⅰ型菌毛的相关蛋白的基因簇，这些基因之间存在相互依赖关系，因此对于Ⅰ型菌毛的功能完整性和黏附能力的维持都是重要的。

本研究中，敏感组仍有一部分菌株对这些抗生素（左氧氟沙星、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、氨苄西林）具有耐药性。环丙沙星、头孢唑林、妥布霉素和氨曲南等抗生素在敏感组中可能仍然有效，对其他抗生素则完全敏感，说明这些抗生素对敏感组中的UPEC菌株具有较高的疗效。耐药组在治疗尿路感染等相关疾病时，如果选择耐药率较高的抗生素，其疗效可能不佳。因此，在考虑治疗方案时，要意识到可能存在耐药株的情况，并积极考虑更换抗感染治疗方案，选择耐药率较低的药物进行治疗。

综上所述，耐药组Ⅰ型菌毛的黏附能力下降与菌株的适应性代价有关，fim及pap基因簇编码的其他基因的转录和缺失可能对Ⅰ型菌毛及P型菌毛的黏附功能产生影响。然而本研究存在局限性，首先是缺乏健康儿科患者作为对照组的尿液样本评估；其次是收集的样本数量较少；最后缺乏抗生素耐药基因的分子评估。因此，为了更全面地分析大肠埃希菌感染机制，需要进行更大规模的多中心研究，包括在分子基因型水平上的深入探索。

参考文献:

[1]钱云妹,汪涛,蔡明丹,等.输尿管镜碎石术后发热性尿路感染患者病原学分析及血清TLR7和HBD-2早期预测价值[J].热带医学杂志,2023,23(4):538-541,549.

基金资助:河北省重点科技研究计划项目(2241ZF369,20232038);

文章来源:陈妍妍,赵青.儿童尿路感染大肠埃希菌耐药性特点及黏附素基因表达研究[J].热带医学杂志,2024,24(09):1247-1251+1273.