间充质干细胞源于中胚层，是一类具有向不同谱系分化能力和自我增殖能力的干细胞，间充质干细胞可以从多种组织中分离出来，如脐带、子宫内膜息肉、月经期血液、骨髓、脂肪组织等[1]，因为间充质干细胞的来源多样性以及可大量获得，使得其对实验和临床应用有很大的研究意义。很多临床试验是基于间充质干细胞的分化潜能而进行的，但由于功能改善和损伤修复与细胞植入或者细胞分化之间缺乏明显相关性，所以LAI等[2]认为间充质干细胞是通过其分泌产物发挥作用的。据报道，间充质干细胞可分泌多种细胞外囊泡[3]，其中包含外泌体，外泌体被认为是间充质干细胞发挥作用的一种重要途径。外泌体是平均直径为30-150nm的细胞外囊泡，有双层脂质膜结构，具有识别未知细胞和分子机制的潜力，这些机制在细胞间通讯、维持体内稳态和疾病的发生发展中发挥着重要作用。外泌体为细胞及组织改变提供了新视角，通过检测体液中的外泌体可以为疾病诊断提供新的思路，基于外泌体的物质信息传递能力可以设计相关治疗疗法[4]。

人脐带间充质干细胞来源丰富[5]，可以通过非侵入性手段获得，拥有更好的增殖性和更低的免疫原性[6]，能定向分化成机体内的各种功能细胞，促进组织修复，调节免疫反应[7]，但其长时间植入体内后，可能会有异常分化的问题[2]，而人脐带间充质干细胞来源外泌体能够避免干细胞异常分化、肿瘤发生和细胞复苏的问题，且拥有低免疫原性、易于获得储存等优点[8,9]，近年来，研究者一直致力于研究干细胞来源外泌体替代干细胞治疗[10,11,12]。

外泌体作为药物和天然化合物的运载工具是目前研究的热点[13]，该实验提取人脐带充质干细胞来源外泌体并鉴定，将人脐带间充质干细胞与其分泌的外泌体进行蛋白质组学分析对比，从蛋白组学层面验证人脐带间充质干细胞来源外泌体与人脐带间充质干细胞的差异是否会影响其免疫原性，从而验证人脐带间充质干细胞来源外泌体的安全性，以便后续研究评价其作为体内基因(药物)递送载体的价值。

1、材料和方法

1.1 设计

细胞学体外实验，两样本均数差异采用t检验，多样本均数差异采用单因素方差分析。

1.2 时间及地点

实验于2018年9月至2020年3月在东南大学医学院完成。

1.3 材料

脐带由南京大学医学院附属鼓楼医院提供，产妇对脐带处理均情同意。实验获得南京大学医学院附属鼓楼医院医学伦理委员会批准。

实验试剂和仪器：胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM低糖培养基、0.25%胰蛋白酶(北京依托华茂生物科技有限公司)；TrypLESelect(美国Gibco公司)；二甲基亚砜(美国Sigma公司)；小鼠抗人PE或APC标记的单抗CD73、CD90、CD166、CD34、CD45(南京福麦斯生物公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(杭州碧云天生物技术公司)；兔抗鼠CD63、CD9抗体(英国Abcam公司)；兔源GAPDH抗体(英国Abcam公司)；聚偏二氟乙烯膜(德国默克密理博公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(二抗)(南京福麦斯生物公司)；化学发光底物(德国默克密理博公司)；超速离心机(美国库尔勒贝克曼公司)；DY702S型稳流电压电泳仪(江苏南达生物科技有限公司)；DYC-40C型湿转膜电泳仪(北京六一科学仪器)；全自动凝胶成像系统(法国Vilber公司)；H-7600型高分辨透射电镜(日本Hitachi公司)；Zetaview型纳米颗粒跟踪分析仪(德国ParticleMetrix公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞培养及鉴定

(1)人脐带间充质干细胞的原代培养：在6h内处理采集的脐带，切除双侧不新鲜的有夹痕或者淤血的部分，用含双抗的PBS充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔，沿脐静脉内腔纵向剪开血管，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成1mm×1mm×1mm大小组织块，贴于用DMEM完全培养基(体积分数为10%胎牛血清+1%青链霉素+DMEM低糖培养基)湿润的T75培养瓶底壁，底壁朝上，置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中，2h后翻转培养瓶，加入5mLDMEM完全培养基，5d后加入5mL上述培养基，12d后全量换液，观察贴块周围贴壁细胞爬出情况，然后隔天换液，当细胞达70%-80%融合时，用2mLTrypLESelect消化液消化后，以1∶4传代培养，计为第1代细胞，取生长良好的第3-6代细胞进行实验[14]。

(2)流式细胞仪鉴定：以TrypLESelect消化液消化收集第2代人脐带间充质干细胞，PBS洗涤2次，分装成每管5×105细胞，分别加入小鼠抗人PE或APC标记的单抗CD73、CD90、CD166、CD34、CD45及同型对照10μL,4℃避光孵育30min,PBS洗涤后用10g/L多聚甲醛固定，流式细胞仪检测分析[15,16]。

1.4.2 超滤序贯超离法提取外泌体

采取将上清液先超滤浓缩再超离沉淀的方式，提高外泌体的提取效率和浓度。具体步骤如下：收集生长良好的第3-6代细胞培养上清液，向100kD的超滤离心管中加入上述上清液1200mL，以4000×g转速离心30min，加入pH7.4的PBS，轻柔吹打，得到含外泌体的超滤浓缩液约120mL。将上述混悬液按照300×g离心10min,2000×g离心10min,10000×g离心30min,100000×g离心70min×2次的步骤进行梯度离心，所得贴于试管底壁淡黄沉淀物即为外泌体，用1mLPBS轻柔充分地吹打混匀，使外泌体充分重悬，保存于-80℃冰箱内备用[17]。

1.4.3 外泌体表征

(1)透射电镜观察外泌体大体形貌：将上述外泌体混悬液约10μL滴于200目碳膜铜网上，静置于超净台内通风15min，用无菌干净滤纸吸取多余的液体，再加入1%醋酸双氧铀负染5min，用无菌干净滤纸吸去多余负染液，静置30min室温下晾干，通过透射电镜观察外泌体形貌、大小，初步估算浓度。

(2)纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径大小、浓度及表面电位：用超纯水将上述外泌体混悬液稀释1000倍，充分混匀，用ParticleMetrix纳米颗粒跟踪分析仪测量外泌体浓度(囊泡数/mL)、粒径分布范围及外泌体膜zeta电位。

(3)BCA法测蛋白含量：按BCA试剂盒步骤测定蛋白浓度，并根据所得浓度调整外泌体稀释倍数，以保证测量的准确性。参数：20μL标本+200μLBCA工作液，37℃放置30min，用酶标仪测定各孔在562nm处吸光度值。

(4)Westernblot检测外泌体中CD9、CD63蛋白表达[18]：用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液裂解细胞，收集的蛋白质样品在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳，将电泳的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在室温下用5%脱脂乳封闭，加入GAPDH、CD9、CD63(1∶1000)一抗在4℃孵育过夜，洗涤印迹，然后在室温下与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶3000)孵育1h，使用化学发光底物在凝胶成像仪曝光检测蛋白表达。

1.4.4 人脐带间充质干细胞来源外泌体蛋白质组学分析

首先进行预实验，分别提取人脐带间充质干细胞及其外泌体中的蛋白质[19]，通过蛋白质定量和凝胶电泳进行质量评估，随后进行FASP酶解预质谱分析，通过数据库比对再次进行样本质量评估。质量评估通过后，对样本进行肽段脱盐、质谱分析，再与数据库对比，选择的数据库为Uniprot＿HomoSapiens＿20386＿20180905，采用MaxQuant软件(版本号1.5.5.1)搜索数据库进行蛋白质定性分析，采用LFQ算法进行蛋白质定量分析[19,20]。GO注释通过Blast2GO对目标蛋白质集合进行序列比对、GO条目提取、GO注释和补充注释[21,22]。KEGG通路注释则通过KOALA软件[23]，首先通过比对KEGGGENES数据库，将目标蛋白质序列进行KO归类，并根据KO归类自动获取目标蛋白质序列参与的通路信息。GO注释与KEGG注释的富集分析则通过Fisher精确检验，比较各个GO分类或KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况，最后进行蛋白质聚类分析，详细实验方法和步骤参照文献[24,25]。

1.5 主要观察指标

(1)人脐带间充质干细胞的形态及表面标记物表达；(2)人脐带间充质干细胞来源外泌体的形态学特征、粒径大小、浓度及表面电位、表面标记物CD9、CD63表达；(3)人脐带间充质干细胞来源外泌体的蛋白组学分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS18.0统计软件处理，实验数据以表示，使用t检验比较两样本均数差异，使用单因素方差分析比较多样本均数差异，P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。

2、结果

2.1 人脐带间充质干细胞形态学

采用组织贴壁法原代培养10d左右，低倍镜下即可观察到有细胞从组织块中爬出，贴壁细胞的形态为多角形或梭形，梭形细胞多呈短纤维状或纺锤形，也有呈圆形的细胞，培养两三周至细胞融合达到80%即可消化传代，可见成纤维状细胞群落生长[26]，见图1。

2.2 人脐带间充质干细胞表面标记物的表达

CD73、CD90、CD166为阳性表达，CD34、CD45为阴性表达，见图2，判定培养细胞为人脐带间充质干细胞。

2.3 人脐带间充质干细胞来源外泌体的形态学特征

透射电镜下观察提取的外泌体分散度较好，多呈杯状圆形或类圆形的膜性小囊泡，可见囊泡的双膜性结构，中央为低电子密度成分，分布较集中且边界清晰，总体粒径范围在40-150nm之间，见图3，所得外泌体大小较均一。

2.4 纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径大小、浓度及表面电位

外泌体粒径分布峰值为(129.5±8.7)nm，膜表面带负电荷，平均zeta电位为(-28.1±3.6)mV，浓度为8.375×1010粒子/mL，见图4。

2.5 人脐带间充质干细胞来源表面标记物CD9、CD63的表达

1200mL无血清培养的人脐带间充质干细胞上清液可分离获得约1mL外泌体混悬液，其蛋白质浓度为0.64g/L，见图5A。Westernblot检测结果显示所得外泌体有特征性膜蛋白CD9、CD63表达，见图5B。

2.6 人脐带间充质干细胞来源外泌体的蛋白组学分析

在定量结果的显著性差异分析和蛋白质聚类分析中，筛选进行统计分析的样本为组内3次重复实验数据中至少有2个非空值的数据，差异表达蛋白质的选择标准为：表达差异倍数大于2.0倍(上下调)且P值(t检验)<0.05。经测算，细胞和外泌体样品中总可数蛋白数为2998种，其中一致性表达的蛋白(差异比<2)为785种，细胞中高表达的蛋白为1755种，外泌体中高表达的蛋白为458种，提示外泌体及其源细胞在蛋白组成方面有一定的同源性和差异性，推测这些差异性表达的蛋白很可能参与了外泌体的合成或者某些特殊的病理状态并与外泌体的功能密切相关，见图6A,B。将外泌体中过表达的蛋白进一步行GO分析，描绘生物学过程、细胞成分、分子功能等属性，KEGG信号通路结果见图6C,D，推测外泌体的功能。结果显示，在外泌体中高表达的蛋白质大多参与了RNA剪接、mRNA加工、蛋白折叠等生物过程，从而参与RNA/DNA等遗传物质及蛋白质的的合成、加工、降解过程，并与多种细胞器及亚细胞膜结构密切相关。KEGG分析也进一步验证了其参与多条信号通路、细胞黏附、细胞外基质受体相互作用，并且还与病毒的致癌作用和多种心肌疾病有关。

3、讨论

近年来人脐带间充质干细胞来源外泌体是一个非常活跃的研究领域[27]。随着开发更多标准化的纯化和分析程序，使得人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取效率得到提高，在神经再生[28]、神经损伤[29,30]、子宫内膜癌[31]、肝衰竭方面的治疗潜力被充分发掘[32]。国内外许多研究表明人脐带间充质干细胞具有来源广泛、低免疫原性、非自我复制性等诸多优点[6,27]，使其在组织修复和疾病治疗方面有着广阔的应用前景[33,34,35,36,37]，人脐带间充质干细胞静脉移植被认为是治疗重症新冠肺炎的一种安全有效的方法[38,39]，可以被认为是重度新冠肺炎的抢救和优先治疗方案。人脐带间充质干细胞显示出低免疫原性是因为主要组织相容性复合体的实际缺失和共刺激配体如CD40、CD80和CD86的缺乏[12,27,40,41]。LIU等[42]发现人脐带间充质干细胞来源外泌体能够明显抑制CD4+、CD8+细胞增殖，在体外具有免疫调节作用；WANG等[43]发现人脐带间充质干细胞来源外泌体在组织损伤修复中更为突出，并且有减轻免疫炎症反应的作用[44]。

作者认为，由人脐带间充质干细胞分泌的外泌体具有母体细胞的特性，同时由于外泌体是纳米级的膜性小囊泡，没有干细胞移植后异常分化和肿瘤发生的风险。现有的外泌体蛋白组学研究中，只有不同来源外泌体或者不同条件下分泌的外泌体之间的蛋白组学对比，没有对外泌体和其母体细胞进行全面的对比分析，同时也没有对两者的低免疫原性进行全面的说明。

该实验采用蛋白组学分析，将人脐带间充质干细胞和其分泌的外泌体进行对比，一方面分析人脐带间充质干细胞分泌的外泌体是否具有人脐带间充质干细胞本身的低免疫原性的优势特性，另一方面希望能够发现证明人脐带间充质干细胞来源外泌体与母体细胞的差异不会影响其低免疫原性的实验依据，从而证明人脐带间充质干细胞来源外泌体的安全性，以便后续研究评价其作为体内基因(药物)递送载体的价值。

有关外泌体表征的鉴定，目前主要通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析仪等进行大体特征观察。透射电镜可以简单直观观察到外泌体的形貌包括形状、大小和部分结构等，可以初步判断外泌体的提取是否成功及提取的外泌体质量。透射电镜观察到该实验提取的外泌体分散度较好，多呈杯状圆形或类圆形的膜性小囊泡，囊泡具有双膜性结构，中央为低电子密度成分，分布较集中且边界清晰，总体粒径范围在40-150nm之间，所得外泌体大小较均一，与部分文献中提到的外泌体结构符合[45]。纳米颗粒跟踪分析仪可以测量1010L-1甚至颗粒浓度更低的样品，是目前应用最广泛的外泌体粒径分析方法，该实验中外泌体粒径和浓度与文献报道一致[46]。

研究发现，外泌体大约有4400余种膜蛋白/分子，这类蛋白质可能参与了免疫、凝血、肿瘤形成等生理病理过程，且可能与细胞的物质传递和信号传导功能有关，因此被认为有成为生物学标志物的潜力[3,47]。既往研究发现CD9、CD63均为外泌体膜的四跨膜家族成员蛋白，也是目前受到研究者广泛认可的外泌体特征性蛋白，可以作为鉴定样品是否为外泌体的指标[48]。CD9在细胞黏附、细胞运动、激活、分化等方面都发挥着重要的调控作用，CD63与病毒感染、肿瘤的浸润与侵袭、免疫及生殖功能等具有密切的关系[49]。Westernblot检测发现提取的外泌体中CD9、CD63呈明显的高表达，结合形貌特征及粒径分析，可以认定提取物为外体。

实验对所提取的外泌体使用BCA法进行蛋白定量，1200mL无血清培养的人脐带间充质干细胞上清液可分离获得约1mL外泌体混悬液，其蛋白质浓度为0.64g/L，与多数文献报道接近[50,51]。

蛋白组学分析结果显示，细胞和外泌体样品中总可数蛋白数有2998种，其中785种为一致性表达的蛋白，细胞中有1755种高表达的蛋白，外泌体中有458种高表达的蛋白，这显示外泌体和其源细胞在蛋白组成方面有同源性，但也存在差异性，进一步对差异的蛋白品种是否参与免疫过程进行了具体分析；根据GO分析结果，在外泌体中高表达的主要差异蛋白大多参与细胞的构成、钙、铁等离子的结合、蛋白的结合和受体的组成，这直接或者间接与外泌体所具有的结构和功能有关，高表达的主要差异蛋白中有很多细胞组成蛋白，也可以证明外泌体与母体的相似性，证明了外泌体的来源。同时高表达的主要差异蛋白也参与了RNA剪接、mRNA加工、蛋白折叠等生物过程，从而参与RNA/DNA等遗传物质及蛋白质的合成、加工、降解过程，KEGG分析也进一步验证了其参与多条信号通路、细胞黏附、细胞外基质受体相互作用，并且还与病毒的致癌作用有关，值得注意的是，其与肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室心肌病等疾病也密切相关。WANG等[52]也发现人脐带间充质干细胞来源外泌体可通过抑制miR-125b-5p来促进Smad7表达，可作为改善急性心肌梗死后心肌修复的潜在治疗方法。在GO分析的差异高表达蛋白以及KEGG分析中，作者并没有发现有关免疫方面的差异或对免疫功能的影响，证明外泌体和母体细胞一样具有较好的低免疫原性和安全性。

总体而言，人脐带间充质干细胞及其来源外泌体可通过细胞学技术成功提取、鉴定及保存，经过蛋白组学分析，认为外泌体与其母体细胞相比有一定的同质性和差异性，同质性可以直接证明该外泌体确实来源于人脐带间充质干细胞，而通过GO分析和KEGG分析发现高表达的差异蛋白功能均和免疫无关，故证明人脐带间充质干细胞来源外泌体较好地继承了母体细胞的免疫特性即拥有低免疫原性，进一步验证了人脐带间充质干细胞来源外泌体的安全性，后续实验进一步深入研究体内基因(药物)递送载体的价值。

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文章来源：单政铭,陶述春,胡春梅,张治元,丁一楠,何梦铖,唐秋莎.人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取､鉴定和蛋白组学分析[J].中国组织工程研究,2022,26(19):3180-3186.