焦亡是由病原体相关的分子模式触发(PAMPs)或损伤相关分子模式(DAMPs)刺激的一种程序性坏死细胞死亡，包括细胞内脂多糖(LPS)、细胞外三磷酸腺苷(ATP)、胞质双链DNA、细菌鞭毛和颗粒物质[1～4]。DAMPs激活模式识别受体(PRRs),组装形成炎性小体含NLR家族Pyrin域蛋白(NLRP3)后招募并活化半胱氨酸天冬酶(Caspase)-1,切割GSDMD蛋白为GSDMD-C和GSDMD-N,后者在细胞膜上“打孔”,进而导致细胞焦亡，释放炎性介质，诱发强烈的炎性反应[5～7]。而炎症与乏氧是相辅相成的，持续剧烈的炎症促使细胞内的耗氧量增加，形成乏氧微环境[8～11]。乏氧诱导因子(HIF)-1α作为细胞内调控乏氧的关键因子是否参与调控动脉粥样硬化(AS)巨噬细胞焦亡进程的研究较少。本研究拟运用利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建HIF-1α敲低的巨噬细胞模型，探究其对巨噬细胞焦亡过程的影响及焦亡相关蛋白的调控作用。另外，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是AS的重要危险因子，可触发巨噬细胞中HIF-1α的激活而增加细胞内炎症因子白细胞介素(IL)-1β,导致巨噬细胞糖酵解和葡萄糖代谢重组，脂质失稳态，进而促进胆固醇积累，加速AS进程[12,13]。因此，本研究探究了HIF-1α对巨噬细胞脂质吞噬功能的影响，进而揭示其与AS进程的关系。

1、材料和方法

1.1材料

Ana-1小鼠巨噬细胞和HKE293T均来自博士德生物技术有限公司；RPMI1640和DMEM高糖培养基购自Gibco公司；南美特级胎牛血清(FBS,Gmini);2×Rapid Taq Master Mix来自Vazyme公司；T7酶切试剂盒购自唯尚立德生物技术公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜来自Millipore; RNA提取试剂Trizol来自TaKaRa;逆转录试剂盒来自赛默飞(C#:K1622);彩色预染蛋白质分子来自赛默飞世尔科技(C#:26616);兔抗β-肌动蛋白(actin; C#:200068-8F10)、酶切(Cleaved)-Caspase-1(C#:341030)、HIF-1α(C#:340462)均购自正能生物；Caspase-1(C#:14F468)来自诺为(NOVOS);GSDMD(C#:ab219800)来自abcam; NLRP3(C#:WL02635)来自万类生物；GAPDH(C#:200306-7E)、流式细胞仪购自艾森生物；显微镜购自奥林巴斯(C#:CKX41)。

1.2构建携带单链导向RNA片段的病毒载体并筛选有效单向导RNA(sgRNA)

靶向HIF-1α的sgRNA(Cr1/Cr2)序列获自网站Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA | IDT(idtdna.com),于擎科生物科技有限公司合成sgRNA,经退火、酶切链接到携带Red2荧光的慢病毒载体。包装病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞系(3T3细胞),提取基因组，T7酶切鉴定检测sgRNA工作效率。

1.3构建HIF-1α基因敲低的单克隆巨噬细胞系

用293T包装病毒24 h后拍照，收集病毒感染Ana-1细胞，用显微镜拍明场和荧光照片，用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)荧光阳性细胞比例，并依据细胞总数梯度稀释后铺96孔板中培养，待细胞长到合适密度后，提基因组用T7核酸内切酶初步确定突变效率、PCR基因组测序、最后用TA克隆筛选白色菌斑，提质粒测序确定单克隆细胞突变形式。将HIF-1α 基因转染到Ana-1细胞中，并细胞分组为：阴性对照(Scramble)组和敲低(sgHIF-1α)组。

1.4 T7酶切初步验证细胞内HIF-1α基因是否发生突变

选取初步PCR明显的条带于95℃、5 min退火；37℃反应30 min后；加上样缓冲液进行核酸电泳；成像分析。

1.5 TA克隆

取测序结果正确的基因组进行聚合酶链反应(PCR),用PCR的产物纯化过柱回收；再用PCR纯化过柱产物，用TA克隆相关试剂盒进行TA连接并转化、挑菌、摇菌、提质粒；后送擎科生物公司测序。

1.6 Western印迹

蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移到PVDF膜上，然后用含0.1%吐温20的磷酸缓冲液(PBST)配制的5%脱脂奶粉作为封闭液在室温下封闭2 h。随后孵育一抗(HIF-1α、NLRP3、Caspase1、GSDMD、β-actin、GAPDH)于4℃过夜，PBST清洗5 min×6次，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠和兔二抗室温孵育1 h, PBST清洗后，采用化学发光显影液显影并分析。

1.7实时荧光定量PCR

采用总RNA试剂提取试剂盒(TAKARA)从细胞中提取RNA,再将RNA进行逆转(cDNA合成试剂盒Thermo),使用2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)进行PCR检测，PCR引物由擎科生物公司合成，GSDMD正向引物：5′-CATGTGTCAACCTGTCAATCAAG-3′,反向5′-CATCGACGACATCAGAGACTTT-3′;IL-1β正向引物：5′-TGGACCTTCCAGGATGAGGACA-3′,反向5′-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3′;IL-1α正向引物：5′-CTGCCATTGACCATCTCTCTC-3′,反向5′-AACTGATCTGTGCAAGTCTCAT-3′;NLRP3正向引物：5′-TTCCCAGACACTCATGTTGC-3′,反向5′-AGAAGAGACCACGGCAGAAG-3′。

1.8扫描电镜

50μg/ml的ox-LDL诱导Scramble组和sgHIF-1α组48 h后显微镜下观察细胞形态并拍照；2.5%戊二醛固定细胞，然后用30%、50%、70%、90%和100%乙醇，依次脱水，乙醇∶乙酸异戊酯(3∶1、1∶1、1∶3)和醋酸异丙酯在室温下浸泡15 min,最后在扫描电子显微镜(HITACHI,SU8220,日本东京)下观察拍照[14]。

1.9酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β

HIF-1α敲低细胞系用ox-LDL诱导24 h后收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，低速离心20 min,将上清转移到新的试管中，使用IL-1βELISA试剂盒(Fine Test)测量IL-1β含量。

1.10细胞膜红色荧光探针(Dil)和油红O染色

50μg/ml的ox-LDL诱导细胞24 h, DiI染色：100μl DiI工作液重悬细胞，37℃避光摇孵15 min,加入100μl 4′,6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)孵育5 min。油红O染色：用0.5%盐酸75%乙醇洗一次，10%多聚甲醛固定摇孵10 min;弃原液，油红O工作液在室温下摇孵20 min,弃染液，超纯水洗2次，苏木素工作液复染1 min;超纯水洗2次，甘油明胶封片。

1.11统计学处理

采用SPSS22.0软件进行t检验。

2、结 果

2.1运用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建HIF-1α敲低细胞系

2.1.1成功筛选获得有效的sgRNA

CRISPR/Cas9质粒主要元件为sgRNA、Cas9和Red2,两个启动子U6和EFS(V2TR)。见图1A。由图1B可见当同时携带sgRNA和Cas9的病毒感染目标细胞24 h后，细胞将表达Red2红色荧光。与阴性对照比较，sgHIF-1α.Cr1及sgHIF-1α.Cr2细胞基因组被成功酶切为大小不同的多条核酸条带(图1C)。

2.1.2成功构建HIF-1α基因敲低的单克隆细胞系

sgRNA和Cas9分别克隆到TREtight/AtTA两个病毒载体，构成可调控敲低系统(图2A)。双质粒病毒包装感染Ana-1细胞，感染的细胞经梯度稀释挑取单克隆细胞，增殖期的Scramble组和sgHIF-1α组单细胞在镜下观察到荧光比例近100%,流式结果与观察结果一致(图2B、C)。单克隆细胞测序峰图显示5号细胞基因组序列峰图呈均匀一致单峰；4号和6号细胞基因组序列峰图为均匀重叠双峰；此外，从3个单克隆细胞基因组经TA克隆测序的分析结果发现，5号细胞为双染色体同时缺失非3的倍数的碱基，4号单克隆细胞双染色体均有缺失突变；6号细胞一条染色体为非3倍数的碱基缺失、另一条染色体为大量碱基突变(图2D)。Western印迹结果显示sgHIF-1α组单克隆细胞的HIF-1α蛋白水平均明显低于scramble组(0.33±0.14 vs 1.00±0.16;n=3,t=5.50,P<0.05)。见图2E。

2.2敲低HIF-1α对巨噬细胞形态的影响

Scramble组和sgHIF-1α组细胞经ox-LDL诱导后，光镜下可见如图3A中的黑色箭头所示，Scramble组细胞膨大肿胀，细胞膜外周有气泡状的突出物，而sgHIF-1α组细胞则未见肿胀和气泡状突出；从扫描电镜结果可知，Scramble组细胞膜形成较多大孔隙(如箭头所示),而sgHIF-1α组细胞膜上未见明显大空隙(图3B)。

2.3敲低巨噬细胞内HIF-1α抑制了焦亡的发生

sgHIF-1α组细胞中GSDMD表达量、Caspase1蛋白及mRNA水平显著高于Scrmable组，而GSDMD-N和C-Caspase1蛋白表达量则显著低于Scrmable组(P<0.05)。见图4、表1;ELISA进一步检测发现Scramble组细胞上清中炎症因子IL-1β,焦亡相关的炎症因子IL-1α、IL-1β、iNOS、NLRP3和TNF-α的mRNA水平均显著高于sgHIF-1α组(P<0.05)。见表1。

图1有效sgRNA的筛选结果

2.4敲低HIF-1α抑制巨噬细胞吞噬脂质的功能

与sgHIF-1α组相比，Scramble组Dil和DAPI染色后，DiI与胞膜的脂质结合，Scramble组荧光强度明显比sgHIF-1α组增强(0.95±0.05 vs 0.64±0.10;t=3.17,P<0.05,n=3)。油红O染色结果可见sgHIF-1α组巨噬细胞的脂滴吞噬功能显著低于Scramble组(0.60±0.01 vs 0.90±0.10;t=3.70,P<0.05,n=3)。见图5。

图2 HIF-1α敲低的单克隆巨噬细胞鉴定

图3 Scramble组和sgHIF-1α组细胞焦亡形态(×20)

图4敲低巨噬细胞内HIF-1α后焦亡相关蛋白表达

表1两组焦亡相关蛋白及炎症因子比较

3、讨 论

CRISPR/Cas9系统是细菌抵御如噬菌体等外源DNA入侵时，以RNA导向精确打靶系统。该系统包含非特异性核酸酶(Cas9)和可编辑序列特异性CRISPR RNA(crRNA),由crRNA引导Cas9特异性切割基因组DNA,在基因组DNA修复过程中由于非同源重组修复而产生碱基插入、突变或缺失等，最终达到敲低目标基因的作用[15～19]。现有CRISPR/Cas9质粒系统多为同一载体携带Cas9和crRNA,分子量较大，极大限制其进入细胞从而降低基因编辑效率。因此，在本研究中CRISPR/Cas9系统两个必要元件分别存在于不同病毒载体：Cas9位于含有可调节元件AtTA病毒载体，crRNA位于含TREtight并携带GFP荧光病毒载体；由此提高病毒包装效率，且两个载体携带的可调节元件互为条件，目标细胞感染Cas9和crRNA后将表达GFP荧光，有利于流式分选，单克隆细胞挑取等，便于质控和提高工作效率。

CRISPR/Cas9是在基因组水平上直接靶向干预基因的mRNA和蛋白表达水平，从根本上破坏基因功能，更能直接反映细胞内基因功能。由此该基因编辑技术已得到了广泛应用，从而更好了解生物体和疾病中的靶基因功能、疾病发生发展机制、药物作用靶点和作用机制[20～23]。

HIF-1α作为乏氧诱导因子在不同细胞组织中均有表达，如肿瘤组织、AS进程中的巨噬细胞等，在缺氧、炎症等状态下的重要因子而发挥着重要的病理生理功能[24～27]。本研究中运用可调控CRISPR/Cas9基因编辑系统对巨噬细胞内的HIF-1α基因进行编辑，并有效敲低细胞内HIF-1α基因，获得相应单克隆细胞模型。本文对HIF-1α基因功能的初步探索中发现，焦亡诱导的HIF-1α敲低巨噬细胞未见明显焦亡现象，且经典焦亡途径相关蛋白剪切体显著降低、下游炎性因子的mRNA和蛋白水平也随之降低。由此可见，HIF-1α参与调节炎症刺激因子所致巨噬细胞的焦亡过程，其机制是通过调节细胞内的经典焦亡途径中Caspase1、GSDMD蛋白及其剪切体表达，从而改变下游炎症因子IL-1α、IL-1β、TNFα、INOS,NLRP3的mRNA表达水平和蛋白水平，最终促进巨噬细胞焦亡。另一方面，巨噬细胞是AS发生发展过程中的关键细胞之一，而HIF-1α基因也是参与巨噬细胞泡沫化进程的重要促进因子[28～31]。因此，本研究中单克隆细胞模型中发现HIF-1α表达降低能明显抑制巨噬细胞的脂滴吞噬功能，这提示AS进程中HIF-1α可能是巨噬细胞泡沫化的重要影响因素之一。

综上所述，本研究成功运用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲低巨噬细胞内HIF-1α基因，获得有效敲低HIF-1α的单克隆细胞模型；在此基础上初步发现HIF-1α促进巨噬细胞的焦亡过程，且该过程可能进一步增强巨噬细胞的脂滴吞噬功能而加速其泡沫化进程参与AS发生发展过程。但是，本研究仅在细胞水平上的一些工作，未来将结合体内疾病模型研究进一步阐释HIF-1α在AS疾病发生发展进程中的作用和相应的机制。

参考文献:

6郭旭男,边云飞,张玥,等.非编码RNA调控的细胞焦亡在动脉粥样硬化中作用机制的研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志,2021;29(12):136-40.

8王慧星,韩晨阳,陈红光,等.HIF-1α在氢抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞炎症反应中的作用[J].中华麻醉学杂志,2020;40(7):881-4.

15李浩可,何衍佶,时迎旭,等.利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系[J].重庆医科大学学报,2019;44(9):1127-33.

16孙菱,康月茜,唐弘,等.利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响[J].重庆医科大学学报,2018;43(1):121-6.

17曾婧,刘晗,李为,等.利用CRISPR/Cas9系统建立斑马鱼Morn3基因敲除模型[J].重庆医科大学学报,2018;43(11):1449-52.

18高庆祝,汪凯,梁利,等.基于CRISPR/Cas9系统构建ARID2基因敲除模型并探索其对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响[J].重庆医科大学学报,2017;42(7):850-5.

19文丹,黄蓉,谢建平,等.运用CRISPR/Cas9技术构建敲除体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因的ACT-1人未分化甲状腺癌细胞系[J].细胞与分子免疫学杂志,2020;36(5):419-24.

基金资助:南充市科技项目(19SXHZ0443);川北医学院资助项目(CBY21-ZD05,CBY21-QA31);

文章来源:郭文,黄蓉,文丹,等.利用CRISPR/Cas9系统研究HIF-1α对巨噬细胞焦亡的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(23):5817-5823.