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诱导多能干细胞来源表皮干细胞与人脱细胞羊膜组织相容性研究

2024-05-12 36 上传者：管理员

摘要：目的:研究诱导多能干细胞(iPSCs)来源的表皮干细胞与人脱细胞羊膜的组织相容性，分析其构建皮肤替代物的可行性。方法:通过调控类风湿关节炎(RA)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、表皮细胞生长因子(EGF)信号通路，将诱导多能干细胞定向分化为表皮干细胞，随后将该细胞种植于人脱细胞羊膜，以苏木精-伊红(HE)染色、细胞计数试剂(CCK-8试剂)及扫描电子显微镜检测诱导多能干细胞来源表皮干细胞与人脱细胞羊膜的生物相容性。结果:诱导多能干细胞来源的细胞具有类似表皮干细胞形态、表型和基因表达，该细胞培养于人脱细胞羊膜，呈紧密薄片状生长，且增殖力与对照组有显著差异。结论:诱导多能干细胞来源表皮干细胞与人脱细胞羊膜具有较好的生物相容性，是具有潜力的种子细胞。

关键词：
手术治疗
皮肤组织工程
羊膜
表皮干细胞
诱导多能干细胞
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皮肤是保护机体免受物理、化学刺激的屏障，但皮肤也最容易损伤，每年有超过900万患者因皮肤缺损而需要手术治疗[1],其中由烧伤、创伤、肿瘤等引起的大面积皮肤缺损常引发感染、体液丢失、器官衰竭，甚至导致死亡[2]。组织工程皮肤在皮肤缺损修复方面具有一定优势，能替代皮肤的部分功能，并有促进创面愈合的潜力。目前有多种细胞用于皮肤组织工程，包括角质细胞、间充质干细胞、真皮成纤维细胞等[3]。尽管如此，寻找理想的皮肤组织工程种子细胞仍然是一项挑战。在笔者之前的研究中，将诱导多能干细胞(iPSCs)定向诱导为表达特异性的表皮干细胞，这种诱导多能干细胞来源的细胞能够形成新的毛囊间上皮和毛囊、汗腺等皮肤附件[4],是一种具有潜力的组织工程种子细胞。本研究将诱导多能干细胞来源表皮干细胞培养于人脱细胞羊膜，并检测其组织相容性，以进一步研究诱导多能干细胞来源细胞作为皮肤组织工程种子细胞的潜力，现报告如下。

1、材料和方法

1.1实验材料

采用诱导分化的诱导多能干细胞来源表皮干细胞[4]作为种子细胞，已经免疫荧光、流式细胞仪分析、RT-PCR检测明确了该细胞的表型和基因表达。经浙江中医药大学附属江南医院伦理委员会审核通过，筛选梅毒、乙型肝炎及人类免疫缺陷病毒(HIV)阴性的自然分娩产妇为捐赠者，并经患者知情同意后获取胎盘。

1.2实验方法

1.2.1脱细胞羊膜制作

无菌条件下，以0.9%无菌生理盐水清洗胎盘3次，将羊膜自绒毛膜钝性分离，并以PBS清洗。以0.25%胰酶在37℃下消化羊膜30 min, PBS清洗3次至羊膜呈半透明。将羊膜平铺在透光的无菌玻璃平板上，刮除残余上皮细胞及浆液性渗出物，PBS清洗3次。将羊膜平铺于硝酸纤维素膜上冷冻干燥，干燥后的羊膜修剪为5 cm×10 cm大小，随后进行真空包装及微波消毒，并于4℃下保存。

1.2.2诱导多能干细胞来源表皮干细胞培养于人脱细胞羊膜

羊膜以PBS浸润4 h,再以D-KSFM浸润2 h,使其充分复水。将羊膜修剪为2 cm×2 cm并置于12孔板中，每孔加入0.1%明胶浸没，4℃过夜。吸弃明胶，加入Laminin/D-KSFM浸没羊膜，室温孵育3～4 h。将诱导11 d的诱导多能干细胞来源细胞以DispaseⅡ消化分离，DMEM培养基洗2遍，并以Tryple-Express进一步消化成单细胞，以适量3T3条件培养基重悬。随后将该细胞悬液以1×105个/cm2细胞的密度接种于羊膜上，添加Y-267232的3T3条件D-KSFM培养基培养，隔日换液。培养4 d后，用苏木精-伊红(HE)染色检查细胞贴壁及生长情况，对照组细胞培养于层粘连蛋白铺板的12孔板。

1.2.3诱导多能干细胞来源表皮干细胞复合羊膜扫描电子显微镜检测

将复合细胞的羊膜置于0.1% PBS稀释的2.5%戊二醛磷酸缓冲液中，4℃下固定过夜。吸弃戊二醛，以PBS洗3次，每次15 min。加入锇酸室温固定40 min, PBS洗3次，每次15 min。梯度乙醇脱水，每次10 min。吸弃乙醇，加入醋酸异戊醇继续处理15 min。样品于临界点干燥2.5 h,进行粘台及喷金，随后以扫描电子显微镜(Tecnai G2 F30,FEI,美国)检测拍照。

1.2.4诱导多能干细胞来源表皮干细胞复合人脱细胞羊膜的增殖力检测

羊膜以D-KSFM培养基浸泡复水后，修剪为0.6 cm×0.6 cm小块并转移到96孔板中。将Laminin(60μg/mL,Sigma)添加到96孔板浸没羊膜，并在室温下孵育3 h。将分化11 d的诱导多能干细胞来源细胞以DispaseⅡ消化分离，并以TrypLE Express进一步消化为单细胞。以每孔2×104个细胞的密度将诱导多能干细胞来源细胞接种在培养皿中，于37℃、95%湿度下培养24 h,隔日换液。分别在细胞接种后的第1,2,3,4,5,6,7天取羊膜组和对照组的3个复孔，每孔加入10μL CCK-8,37℃条件下培养1.5 h后，酶标仪检测每孔在450 nm波长的吸光度(OD)值，重复检测3次。

1.3统计学方法

以单因素ANOVA方差检验或配对t检验评估统计学差异，P<0.05差异有统计学意义，采用Graphpad Prism version 9.5软件进行统计分析。

2、结果

2.1羊膜的制作

羊膜经胰酶消化后，HE染色结果(图1a)显示羊膜呈半透明。扫描电子显微镜检测羊膜的微观结构(图1b)显示羊膜结构完整，表面多孔，说明经过胰酶消化及机械处理，得到了结构完好的人脱细胞羊膜支架。

图1经消化后的羊膜(×100)

2.2诱导多能干细胞来源表皮干细胞培养于人脱细胞羊膜

接种后第4天，光学显微镜下观察到细胞贴壁于人脱细胞羊膜并增殖，HE染色结果证实细胞生长于人脱细胞羊膜(图2b)。接种后第4天，镜下观察诱导多能干细胞来源表皮干细胞生长于人脱细胞羊膜，扫描电子显微镜观察到培养于羊膜的诱导多能干细胞来源表皮干细胞呈高密度的薄片状生长，部分细胞的形态与表皮干细胞相似，呈特异性的多边形形态(图2)。

图2诱导多能干细胞来源细胞培养于羊膜(显示诱导多能干细胞来源细胞在羊膜表面黏附良好)

2.3诱导多能干细胞来源表皮干细胞复合人脱细胞羊膜的增殖力检测

随后对生长于羊膜的诱导多能干细胞来源表皮干细胞进行CCK-8增殖力检测。如图3所示，前2 d细胞在羊膜上的密度逐渐降低，2 d后细胞密度逐渐增加。对照组细胞生长于Laminin上，接种后细胞密度也在初始时降低，3 d后细胞密度开始增加。接种后第4天，羊膜上培养的细胞显示出比对照组层粘连蛋白上培养的细胞更高的增殖能力，说明细胞与羊膜具有较好的生物相容性。

图3 CCK-8检测羊膜上的诱导多能干细胞来源细胞的增殖力高于对照组

3、讨论

羊膜是胎盘的主要结构组成之一，其外层为绒毛膜，内侧为羊水。正常人羊膜呈半透明，厚度为0.02～0.50 mm,且具有一定韧性，其内无血管、神经和淋巴管[5]。羊膜自外至内分为海绵层、纤维细胞层、致密层、基底膜及上皮细胞层。研究证实羊膜含有丰富的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原、纤维粘连蛋白及层粘连蛋白等成分，适于细胞黏附增殖迁移[6]。羊膜也含有能促进上皮细胞的分化、移行和增强上皮细胞的黏附性的成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)等[7]。同时，研究证实羊膜能减轻炎症反应、缩短炎症持续时间，可阻止白细胞浸润，抑制多种蛋白酶(如胰蛋白酶、纤维蛋白酶、组织蛋白酶G、胶原蛋白酶等)的活性，且含有丰富的溶解酶、裂解体和补体，可以抑制炎症反应和实质溶解[8]。Akle等[9]和Andinolfi等[10]研究显示人羊膜上皮细胞表面不表达β2微球蛋白及HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR抗原，同时表达Ib抗原抑制Ia抗原，这些免疫学特点佐证了羊膜的低免疫原性。20世纪初期含羊膜的胎膜被移植于烧伤和溃疡创面，用作临时的敷料覆盖皮肤伤口，随后羊膜在眼科有着更为广泛的应用[11,12]。羊膜具有减少炎症反应、促进创面上皮化、减少创面疤痕形成的作用。

目前有多种基于羊膜的组织工程研究，通过将角质形成细胞、间充质细胞和成纤维细胞培养于羊膜，用于修复软骨和气管等[13,14]。在Sanluis等[15]的研究中，在人脱细胞羊膜两侧分别培养成纤维细胞和表皮干细胞，形成皮肤和表皮结构的皮肤替代物。Wu等[16]报道在人脱细胞羊膜上培养的脂肪来源间充质干细胞用于修复韧带。该类研究显示羊膜作为组织工程的支架具有很大的潜力，然而目前还没有关于在羊膜上培养诱导多能干细胞来源细胞的报道。作为一种具有无限增殖能力和多分化能力的多能干细胞，诱导多能干细胞具备体细胞所没有的多种优势，在皮肤组织工程领域也具有很大的潜力。因此，在本研究中将诱导多能干细胞诱导为表达表皮干细胞特异性基因的细胞，并将其接种到人脱细胞羊膜支架，以构建用来修复全层皮肤缺损的皮肤替代物。结果显示诱导多能干细胞来源表皮干细胞在接种4 d后，观察到贴壁生长于人脱细胞羊膜并形成增殖。CCK-8检测显示，在培养的前2 d接种在羊膜上的细胞数量逐渐减少，但随后逐渐增加，并在第4天表现出比对照组更高的增殖力。该结果直接证实了人脱细胞羊膜为诱导多能干细胞来源细胞提供了更好的增殖环境，此外，笔者猜测前2 d细胞减少可能是由于非表皮干细胞在无类风湿关节炎的D-KSFM培养基中的凋亡导致。经HE染色和扫描电子显微镜证实，种植于羊膜的诱导多能干细胞来源表皮干细胞呈现紧密排列的薄片状生长，细胞形态接近于表皮干细胞的多角形且紧密黏附于人脱细胞羊膜，间接证实了羊膜作为皮肤组织工程支架的生物相容性。

参考文献:

[3]林苗远,李豫皖,刘毅,等.组织工程皮肤的研究热点及应用价值[J].中国组织工程研究,2022,26(1):153-159.

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[5]于洪蛟,徐林,张立阳,等.羊膜的结构功能特性和临床应用[J].医学研究杂志,2015,44(10):174-177.

[6]王旗,杨晓双,王达利.水凝胶三维培养对人羊膜间充质干细胞特性及旁分泌效应的影响[J].中国组织工程研究,2020,24(22):3460-3466.

[11]王丹,尹晶,王玉英,等.人源脱细胞羊膜与脱细胞羊膜下层组织修复皮肤缺损[J].中国组织工程研究,2020,24(34):5570-5576.

[12]裴森.羊膜移植治疗难治的角膜溃疡的临床观察[J].中华眼外伤职业眼病杂志,2021,43(11):871-874.

[13]姜良斌,韦标方,冯志,等.人脱细胞羊膜与骨髓间充质干细胞复合体修复关节软骨缺损[J].中国组织工程研究,2017,21(26):4113-4118.

[14]崔永,龚民.羊膜——易于获得的器官修复与重建的生物材料[J].中华胸心血管外科杂志,2008,24(6):423-424.

基金资助:浙江省医药卫生科技计划项目(2021438727); 杭州市萧山区重大科技计划项目(2020213);

文章来源:周化腾,王洪顺,杜伟斌,等.诱导多能干细胞来源表皮干细胞与人脱细胞羊膜组织相容性研究[J].中国中医骨伤科杂志,2024,32(05):14-17.