内质网（endoplasmic reticulum,ER）是一种复杂、高效且动态变化的细胞器，它具有监测细胞活动、响应外界刺激且及时作出调节的功能。在各种生理或病理因素的刺激下，内质网功能损伤，将导致未折叠/错误折叠蛋白在内质网管腔内积累即内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。随后，细胞通过启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR），纠正错误折叠蛋白，以缓解ERS，维持细胞稳态[1]。一旦ERS过度激活，超过细胞所能承受的阈值，将使细胞走向不可逆的死亡，其死亡方式就包括类凋亡[2]。类凋亡（paraptosis）是一种新的程序性细胞死亡方式，以内质网和线粒体（mitochondrion）肿胀、细胞质空泡化为典型特征[3]。研究表明：ERS是导致内质网肿胀及细胞空泡产生的关键因素[4]，并且ERS还对其他多种类凋亡信号通路起到一定的作用[2,5]。同时，既往的研究中已提出类凋亡空泡膜起源于内质网[6,7]。以上这些都说明内质网应激与类凋亡密切相关，因此，本文对ERS参与调控的类凋亡过程与机制进行综述，以期为今后深入研究ERS与类凋亡的关系提供相应的理论依据。

1、内质网应激

内质网应激是细胞在多种应激源（例如低氧、营养缺乏或药物作用时）干扰下启动的一种适应性反应。早期的ERS主要通过激活UPR抑制蛋白合成，加速蛋白转运降解，减轻错误蛋白积累，以缓解内质网应激状态，恢复细胞稳态[1]。然而在持续、强烈的ERS作用下，UPR机制不能及时平衡蛋白折叠的缺陷，最终诱导细胞损伤甚至死亡[8]。

UPR机制主要涉及3条通路：PERK(protein kinase RNA-dependent-like ER kinase）、ATF6(activating transcription factor 6）、IRE1(inositol requiring enzyme-1）。当未折叠/错误折叠蛋白质持续积累时，这3条通路可通过上调下游C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的表达激活细胞程序性死亡机制。目前CHOP在类凋亡中的关键调控作用已被证实，二甲氧基姜黄素（dimethoxycurcumin)[9]、洋橄榄叶素（elaiophylin)[10]和厚朴酚（Honokiol)[11]等多种化合物诱导的类凋亡均与CHOP蛋白相关。近年来有文献表明：ERS相关的后续反应，如ER钙离子耗竭、线粒体钙离子超载等在多种化合物诱导的类凋亡中也起着关键的作用[12,13]。此外，ERS还与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路的激活、蛋白酶体抑制等途径密切相关[10,14]。

2、类凋亡

Samaha等[15]于1995年首次使用para-apoptosis一词来描述以胞质空泡化为特征的细胞死亡形式，其中报道的形态学改变和生化特征可能已包含类凋亡。2000年，Sperandio等[3]通过过度表达胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R）成功诱导293T细胞和小鼠胚胎成纤维细胞发生类凋亡。而后他们对类凋亡的形态特征进行描述：细胞在发生类凋亡时，会出现线粒体和内质网肿胀导致的细胞质空泡化，然而该过程不涉及凋亡小体、核固缩和DNA断裂。之后，Sperandio等[16]在2004年发现IGF1R通过MAPK诱导类凋亡，而该过程可被AIP-1/Alix(ALG2-interacting protein 1 or ALG2interacting protein X）抑制。在未来几十年的研究中，AIP-1/Alix被证实是内源性类凋亡抑制蛋白，并且使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）可显著抑制类凋亡现象产生。此外，既往研究还表明：类凋亡的产生涉及ERS、蛋白酶体抑制、活性氧（reactive oxygen spe⁃cies,ROS）的产生、细胞Ca2+稳态失衡等多种因素调控[6,17,18]。因此，细胞类凋亡作为一个复杂、动态的过程，需要多种因素的参与，然而各因素间都存在相同的作用点，即关键细胞器——ER与线粒体。ER与线粒体空泡化不仅是类凋亡的典型特征，更是类凋亡细胞共有的形态特征。科研人员在证明空泡膜来源的实验中发现：空泡膜主要来自扩张后的ER，而ERS是ER扩张的主要因素。这个发现表明ERS与类凋亡激活存在密切联系[6]，但其具体机制还需进一步探究。

3、内质网应激调控类凋亡的分子机制

ERS可诱导类凋亡的发生，其作用机制涉及多个分子及相应信号通路的参与，目前报道的主要与PERK、ATF6、IRE1、Ca2+等途径有关，相关信号通路如图1所示。

图1 UPR信号介导类凋亡的机制示意图 

说明：（1）IRE1启动ER表面特定mRNA的非常规剪接，然后编码转录因子XBP1s，激活MAPK级联反应的C-JunN末端蛋白激酶（JNK）表达。（2）PERK通过磷酸化elF2α翻译起始因子，选择性刺激转录因子ATF4,ATF4介导对CHOP的转录诱导。（3）转录因子ATF6在感受内质网应激后，进入高尔基体复合体，裂解为活性片段后发挥作用。

3.1 PERK信号传导与调控机制

PERK是一种Ⅰ型ER跨膜蛋白激酶。正常情况下，PERK与ER分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78/Bip）稳定结合而无活性。当细胞发生ERS时，PERK与Bip分离，并且被活化，从而引起真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor,eIF2α）磷酸化，以减少新生蛋白合成，缓解ER负荷[19]。随着ERS的进行，磷酸化的eIF2α特异性地增加激活转录因子4(activating transcription factor4,ATF4）表达水平，而ATF4直接作用于CHOP的启动并激活其转录[20]。研究表明：CHOP是细胞促生存机制向死亡机制转变的关键，而CHOP可能触发一系列细胞响应，如蛋白酶体抑制、钙平衡紊乱、ROS增加等，进而诱导细胞类凋亡[9,20]。

据报道，大黄酸衍生物4a(1,8-Bis(benzyloxy)-9,10-anthraquinone-N-(2-hydroxyethyl)-3-carboxamide）作用于卵巢癌细胞后，通过PERK介导的ERS和MAPK级联反应，诱导卵巢癌细胞类凋亡，此过程伴有AIP-1/Alix蛋白表达的下调[21]。最新研究发现：经第三代EGFR-TKI奥希替尼（Osimertinib）处理胶质母细胞瘤后，Bip、CHOP蛋白表达上调，细胞出现空泡化，而靶向PERK或eIF2α可显著降低CHOP表达，这表明PERK通路参与奥希替尼诱导的细胞死亡[22]。有趣的是，抑制或敲除黑色素瘤细胞中的PERK蛋白后，T细胞介导的抗肿瘤免疫反应显著增强，且该过程伴随明显的ERS和类凋亡形态特征[2]。综上表明：PERK信号传导在类凋亡中发挥关键作用，但其具体机制仍待进一步研究。

3.2 ATF6信号级联及其调控机制

ATF6是一种Ⅱ型内质网跨膜蛋白，它属于ATF/CREB碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP)DNA结合蛋白家族，其结构包括细胞质中的bZIP结构域和内质网腔内的应激感知结构域[23]。在ERS的条件下，以ATF6与结合的BiP蛋白分离启动UPR，随后移动到高尔基体区域，裂解为活性片段，进入细胞核，与通用型转录因子NF-Y(nuclear factor-Y）结合为二聚体，激活内质网应激反应元件ERSE(ER stress response element）基因的转录，从而促进特异性基因表达，其中包括XBP1(x-box binding protein 1）与CHOP[19,24]。此外，为了重建细胞稳态，UPR可触发细胞周期停滞，如G1细胞周期停滞将影响细胞死亡[24]。

近年来，研究报道化合物1α,25-二羟基维生素D3(1α,25 dihydroxyvitamin D3)[25]和紫杉醇（taxol)[26]诱导的细胞类凋亡均与ATF6相关。其中1α,25-二羟基维生素D3与盐霉素联合使用时，不仅上调ATF6、CHOP蛋白表达，而且成功阻滞细胞周期，显著抑制MCF-7乳腺癌细胞系增殖。然而，紫杉醇诱导的类凋亡虽然存在ATF6上调，但使用shATF6沉默ATF6并不能显著抑制紫杉醇诱导的细胞质空泡化。因此，ATF6在类凋亡中是否发挥关键作用仍需深入探索。

3.3 IRE1α信号级联及其调控机制

IRE1α是进化上最保守的ERS信号通路之一，IRE1α的氨基末端位于内质网腔，而羧基末端位于细胞质，这种分布方式使IRE1α能够感知ER中蛋白质折叠状态的改变。在ERS状态下，IRE1α与分子伴侣Bip解离，以暂时稳定未折叠/错误折叠蛋白质。随后，IRE1α的构象经寡聚化和磷酸化而改变，从而激活其内切核糖核酸酶（RNase）活性，导致XBP1 mRNA剪切，引发ERS响应及其后续的细胞死亡[27,28]。然而IRE1α介导的XBP1 mRNA剪切需要ATF6的参与[29]。此外，活化的IRE1α还可通过诱导细胞凋亡信号转导激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）表达来激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，其中包括c-Jun N末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和p38MAPK[28]。

最新研究发现：铊离子（TI)[30]通过调控IRE1和ATF6表达，激活ERS途径诱导犬肾细胞（MDCK）类凋亡，同时该过程伴有XBP-1剪接和核易位，而蛋白合成抑制并不能阻止以上现象。此外，查尔酮素（Chalcomoracin)[31]可同时作用于PERK、IRE1α、ATF6，触发ERS，诱导大细胞肺癌H460细胞类凋亡，但其在肺腺癌A549细胞中只诱导IRE1α的上调。有趣的是，当环孢素A[7]作用于宫颈癌细胞时，IRE1α与PERK蛋白均上调，且伴随JNK蛋白表达，而总的eIF2α水平和ATF6水平却没有明显变化。综上表明：IRE1调控的类凋亡机制与ATF6及MAPK级联反应密切相关，并且在不同细胞系中存在差异。

3.4钙离子稳态失衡及其调控机制

ER与线粒体具有储存及调节Ca2+稳态的功能，而Ca2+对维持细胞稳定性、调节细胞器渗透压具有重要作用。正常情况下，ER作为细胞钙库主要通过膜上的三磷酸肌醇受体（inositol triphosphate receptor,IP3R）和兰尼碱受体（ryanodine receptor,RyR）通道将ER腔内的Ca2+释放到胞质，通过钙泵将胞内的Ca2+泵入ER腔中，从而维持Ca2+稳态。ERS时，ER释放Ca2+促进线粒体外膜（OMM）上的电压依赖性阴离子通道（VDAC）及线粒体内膜（IMM）上的单向转运体（MCU）复合体被激活，Ca2+转运入线粒体，并且线粒体Ca2+浓度比胞质区高10～20倍[5,32]。线粒体轻度摄取可促进氧化磷酸化，导致ATP合成和ROS生成，这对IP3R产生正反馈并进一步诱导Ca2+的释放与吸收[33]。长时间后，线粒体Ca2+超载引发线粒体膜电位丢失，膜通透性转换孔被打开，膜内渗透压增高，水进入细胞器引起线粒体肿胀，而Ca2+稳态失衡又加重内质网Ca2+耗竭及未折叠/错误折叠蛋白质积累，增加ER渗透压以致ER扩张及空泡化[34]。此外，既往研究还证明：IP3R主要集中于线粒体相关内质网膜（mitochondrial-associated ER membranes,MAMs），与VDAC一同调节ER与线粒体的Ca2+通讯，这表明两者存在一定联系[35]。

δ-生育三烯酚（δ-TT)[5]作为一种维生素E衍生物，具有强大的抗癌特性。研究证实δ-TT处理黑色素瘤细胞与前列腺癌细胞后，通过线粒体Ca2+超载与ROS生成诱导类凋亡。用IP3R抑制剂2-APB及VDAC阻断剂DIDS处理黑色素瘤细胞后均成功抑制δ-TT介导的空泡化，且TEM分析显示，细胞中还存在MAMs。在前列腺癌细胞中也具有相同现象[36]。有趣的是，Pyrczak等[6]使用BATTA（细胞外钙螯合剂）RyR抑制剂丹曲林、2-APB阻断松萝酸衍生物2b作用时，只有2-APB阻断类凋亡。以上表明2b诱导的Ca2+来源于内质网，而不是胞外摄取，且依赖IP3R通道转运。因此，ERS可通过调节Ca2+水平激活类凋亡，Ca2+在ERS调控细胞类凋亡的通路中发挥着重要作用。

4、内质网应激与其他类凋亡信号通路的联系

IGF1R的过表达及蛋白酶体抑制及ROS生成均是介导类凋亡的潜在机制，目前的研究已证明三者与ERS之间存在作用。其中，IGF1R可通过膜定位诱导ERS[10,16]，蛋白酶体抑制途径可通过加剧错误折叠蛋白积累，限制蛋白质清除介导ERS[20]，而ROS生成途径则主要通过ERS与硫氧还原蛋白、GSH的相互作用介导类凋亡[37]。

4.1内质网应激与IGF1R介导的类凋亡通路

Sperandio等[3]首先发现IGF1R膜定位在诱导细胞类凋亡过程中的重要作用。Li等[38]于2023年发现：激活的IGF1R从细胞膜定位到ER，磷酸化ER膜上的钙ATP酶2(phosphorylated endoplasmic reticulum calcium atpase 2,SERCA2），扰乱Ca2+转运的过程，引发钙平衡紊乱，这又导致PERK-eIF2α-ATF4信号通路的激活，引发ERS及细胞死亡。此外，含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase 2,SHP2）是细胞IGF1R上调的一个重要介质[39]，并且SHP2是MAPK通路的上游中间体，可通过激活Ras-MAPK通路，诱导细胞类凋亡[10]。

相关研究显示：IGF1R信号通路在许多肿瘤中过度表达，并且能够通过激活MAPK通路和PI3K通路调节细胞生长代谢活动[40]。MAPK主要依靠细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2）、JNK和p38MAPK参与类凋亡[10]，而PI3K则通过激活AKT/mTOR通路，诱导ERS，从而导致细胞类凋亡[11,41]。洋橄榄叶素（Elaiophylin)[10]诱导卵巢癌细胞类凋亡时，SHP2/SOS/MAPK通路被激活，而使用EKR抑制剂U0126可显著减少细胞空泡化，抑制ER扩张，下调CHOP蛋白表达，这表明MAPK通路可能为ERS的上游，调控其发生。此外，最新研究显示：2,2′-二吡啶基酮二硫代氨基甲酸酯叔丁酸（DpdtbA)[41]通过产生ROS，阻滞细胞周期，激活PI3K/AKT，诱导铁死亡耐药性黑色素瘤细胞类凋亡，且细胞空泡来源于ER。而厚朴酚（Honokiol)[11]主要通过激活mTOR诱导急性早幼粒细胞白血病细胞类凋亡，并伴随Bip、ATF4、CHOP等蛋白上调。综上所述，ERS与IGF1R及其下游均存在密切联系，它可能受IGF1R级联反应的调控，介导细胞类凋亡。

4.2内质网应激与蛋白酶体抑制介导的类凋亡通路

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解[42]。其中，蛋白酶体（proteasome）广泛存在于真核生物的细胞核及细胞质中，以26S蛋白酶体（由20S核心蛋白酶体和19S调节蛋白酶体构成）最为常见[43]。正常情况下，蛋白酶体可与泛素连接酶结合发挥其降解作用，以缓解ERS对细胞造成的损伤[44]。在ERS等应激条件下，蛋白酶体抑制诱导泛素化蛋白积累，内质网中未折叠/错误折叠蛋白过度负荷，UPR通路激活，ER渗透压增大，水进入引起ER肿胀甚至空泡化，最终导致类凋亡[13]。因此，多泛素化蛋白的渐进式积累也被认为是蛋白酶体抑制的标志。

另有研究发现：2′-羟基-查尔酮后（HRC)[45]可诱导恶性乳腺癌和宫颈癌细胞中广泛的细胞质空泡化，且空泡来源于ER。细胞中泛素化蛋白Bip和CHOP的增加证明发生了ERS。进一步实验表明，HRC可以与26S蛋白酶体糜蛋白酶样亚基活性位点上的Thr1残基结合，证实蛋白酶体活性抑制，并且使用蛋白酶体抑制剂MG132处理，成功阻止细胞类凋亡发生。6-Shogaol[46]也可通过结合蛋白酶体Thr1残基上的胰凝乳蛋白酶样β5亚基诱导肿瘤细胞凋亡。HQ-11[47]是一种合成的8-羟基喹啉衍生物，通过与胰凝乳蛋白酶样β5亚基的活性位点结合抑制蛋白酶体活性，进而增加泛素化蛋白的积累，进一步激发ERS，抑制乳腺癌细胞生长。且该现象在姜黄素[17]和金诺芬[37]处理的乳腺癌细胞中也可观察到。此外，二甲氧基姜黄素[9]作用于乳腺癌细胞后，可以表现出比姜黄素更强的蛋白酶体抑制和CHOP蛋白表达，经实验证明，其可以诱导更加有效的类凋亡。综上所述，蛋白酶体抑制与ERS在调控类凋亡的过程中存在密切联系，其中26S蛋白酶体对调控类凋亡具有关键作用。

4.3内质网应激与ROS介导的类凋亡通路

肿瘤细胞中ROS的产生会触发细胞死亡的信号级联反应[48]。因此，在许多化合物诱导的肿瘤细胞类凋亡中均可观察到ROS增加，这与硫氧还蛋白（Trx）和谷胱甘肽（GSH）系统及ERS密切相关[37]。研究表明：TrxR(TrxR1位于细胞质，Trx2位于线粒体）与GSH协同维持细胞氧化还原平衡，而抑制TrxR会导致ROS的生成增加，过多的ROS会进一步消耗GSH，破坏细胞稳态[49]。在ERS的条件下，激活的ATF4可通过影响下游谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶CHAC1(glutathione-specific gammaglutamylcyclotransferase 1）进一步降解GSH，并且ATF4与CHAC1的表达呈正相关。此外，敲除TrxR1基因也可增强ATF4与CHAC1的表达[37]。

还有研究发现，中药狼毒大戟的主要活性成分岩大戟内酯B(Jolkinolide B,JB)[49]通过靶向Trx和GSH系统，介导ERS与ROS途径的膀胱癌细胞类凋亡。在进一步的实验中，分别使用抗氧化剂过氧化氢酶（H2O2清除剂）和SOD（超氧阴离子清除剂）抑制ROS生成，然而只有过氧化氢酶明显阻滞JB诱导的细胞死亡，这表明H2O2在JB诱导类凋亡中发挥关键作用。同时，过氧化氢酶还显著抑制细胞中ATF4、CHOP的上调，缓解了ERS，这表明ROS可能是ERS的上游。另外，吡唑并[3,4-H]喹啉的衍生物（YRL1091）作用于乳腺癌细胞后，ROS含量剧增，BiP、ATF4和CHOP蛋白表达上调，细胞出现空泡化，这表明YRL1091通过ROS产生ERS诱导细胞死亡[50]。然而单独使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）或CHX均可阻断ER泛素化蛋白质积累，这表明ROS与ERS可能共同影响类凋亡进程。

针对上述ERS与细胞类凋亡的关系，我们对其所涉及的相关机制进行综合，如图2所示。

图2诱导类凋亡发生的机制图（在文献[5,19,20,21,47,48,49,50]基础上修订总结） 

5、结语

本文综述了ERS通过UPR和Ca2+失衡直接作用于类凋亡的具体机制，并对ERS与IGF1R、蛋白酶体抑制及ROS生成之间的联系进行了补充，以此说明ERS不仅可以诱导细胞类凋亡，而且还不同程度地作用于其他机制。因已知ERS在类凋亡调控中具有重要作用，所以对ERS与类凋亡相关通路、靶点进行挖掘与分析，并对ERS与其他类凋亡机制的相互作用进行深入研究具有一定的意义。然而目前关于ERS直接影响细胞类凋亡的报道较少，其具体机制也未完全阐明，因此ERS与类凋亡的具体关系后续仍需进一步探索。

目前关于类凋亡研究已获得许多发现，但其仍存在尚未解决的问题：（1)ERS还可诱导其他细胞死亡方式，如凋亡、自噬，但ERS在不同死亡方式间切换的关键条件与分子目前仍未知。（2）研究表明：诱导肿瘤细胞发生类凋亡可逆转耐药，但类凋亡在改善耐药方面的分子机制尚未明确。（3)PERK、ATF6、IRE1、Ca2+等在ERS和类凋亡作用的信号转导中，还涉及很多中间分子，其具体作用机制目前仍不明确。基于上述问题，未来的研究方向可以从以下3方面深入：（1）探索ERS作用于不同死亡方式时的异同点，找寻不同死亡方式间切换的关键条件。（2）研究靶向类凋亡逆转肿瘤细胞耐药性的分子机制。（3）深入研究ERS诱导细胞类凋亡的精细分子机制。

基金资助:浙江省基础公益研究计划资助项目(LGF21H280002);台州市科技计划项目(工业类)(22gya02);

文章来源:吴瑜婷,郑雨彤,石惠萍,等.内质网应激诱导细胞类凋亡的机制研究进展[J].台州学院学报,2024,46(03):63-71.