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布鲁氏菌全自动检测法的可行性分析

2024-05-19 76 上传者：布鲁氏菌;自动;检测;试管;凝集;可行性分析;

摘要：为探究全自动虎红平板凝集试验工作站的临床应用可行性，该试验将全自动虎红平板凝集试验工作站别与人工RBT和SAT的检测结果分进行比对，分析此全自动工作站的应用价值。结果显示，在120牛血清样本中，全自动检测结果与人工RBT均检测出36份阳性样本，检测结果一致；而SAT结果呈阳性共计31份，疑似样本7份，2种方法阳性检出结果无差异（P>0.05）。表明全自动虎红平板凝集试验工作站可替代人工检测用于布鲁氏菌抗体的的初筛，但其阳性检出率较SAT偏高，应同时运用其他方法进行确证。

关键词：
凝集
可行性分析
布鲁氏菌
检测
自动
试管
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布鲁氏菌病（简称布病）是由胞内寄生菌布鲁氏菌引起的一种慢性人兽共患传染病，病原菌主要侵害宿主的生殖系统，可造成宿主流产、不孕和睾丸炎[1]，人感染后会出现波浪热、关节炎、肌肉疼痛等症状[2]，其致病性取决于它在巨噬细胞内的繁殖和存活能力[3]。目前，我国北方地区布鲁氏菌病的发病率远高于南方地区，主要集中在内蒙古、甘肃、青海、宁夏等牧区，且屠宰场、牧区饲养员成为该病的高发群体，随着家畜饲养量的增加，南北调运逐渐频繁，使得南方布鲁氏菌病的发病率呈上升趋势[4,5]。

诊断是布病防控的重要环节，实验室常用的诊断方法主要包括虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、全乳环状试验（MRT）、补体结合试验（CFT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等[6,7,8]。RBT是布鲁氏菌常规检测方法之一，由于家畜临床样本量种类多、检测量较大，依赖人工检测的方式被更为便捷的全自动诊断法所取代。本文基于全自动虎红平板凝集试验工作站，通过对比全自动检测法与人工RBT的阳性检出率，及其与SAT检测结果的差异，分析此全自动虎红平板凝集试验工作站临床应用的价值，为布病血清检测提供参考依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

牛血清临床样本120份，置于-80℃保存备用。

1.1.2 仪器与试剂

布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、布氏菌病试管凝集试验抗原购自哈药集团生物疫苗有限公司，布鲁氏菌标准阳性血清和阴性血清购自均购自唐山怡安生物工程有限公司，全自动虎红平板凝集试验工作站由南京应节生物科技有限公司提供等。

1.2 方法

1.2.1 全自动虎红平板凝集试验检测法

将血清样本按照1、2、3等进行编号，随后基于全自动虎红平板凝集凝集试验工作站，参照国家标准GB/T18646—2018《动物布鲁氏菌诊断技术》虎红平板凝集试验的具体操作步骤设置仪器程序进行试验，同时设置标准阳性、阴性血清为对照，对检测结果进行分析，并将结果汇总后导出。

1.2.2 虎红平板凝集试验人工检测法

分别吸取25μL的血清样本和抗原加于玻璃板上，用无菌牙签将其混匀，涂成大约2 cm的圆形，并设置标准阳性、阴性血清作对照，将血清与抗原混匀，4 min后在光下观察试验结果。

1.2.3 试管凝集试验

参照国家标准GB/T 18646—2018《动物布鲁氏菌诊断技术》进行布鲁氏菌试管凝集试验。首先配置0.5%的石炭酸生理盐水稀释液，选择96孔U型板的连续4个孔，在第1孔加入192μL的稀释液，2～4孔加入100μL的稀释液，另外，在第1孔加入8μL的待检血清样本，混匀，依次倍比稀释至第4孔并弃去100μL，随后每孔加入100μL的1∶20稀释的试管凝集试验抗原，置于涡旋仪上混匀30 s。另外，设置标准阳性血清对照组、阴性血清对照组和抗原对照组各2组。

1.2.4 结果判定

虎红平板凝集试验判定标准为阳性对照出现凝集，阴性对照无凝集表明试验成立，待测样品出现可见凝集判定为阳性（+），无凝集判定为阴性（-）。

试管凝集试验判定标准为标准阳性血清1～4孔均出现完全凝集（++++）、标准阴性血清、抗原对照1～4孔均无凝集（-）表明试验结果成立。若待检血清至少存在2个孔出现均匀散铺与孔低（++）及以上凝集现象时判定为阳性（+）；若仅有第1孔呈散装平铺于底部，无凝集现象则判定为可疑，1～4孔均呈白色点状沉淀沉积与孔底，则判定为阴性（-）。

1.2.5 数据分析

将全自动虎红平板凝集试验工作站检测结果分别与人工虎红平板检测结果和试管凝集试验检测结果进行比对，应用GraphPad Prise 9.0对数据进行统计学分析，采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果与分析

将全自动检测法与人工RBT检测法比对发现，在120份牛血清临床样本中仪器与人工检测结果一致，检出阳性血清36份，阴性血清84份，阳性检出率为30%。与试管凝集试验结果比对发现，试管凝集检出阳性样本31份，疑似样本7份，疑似样本中虎红平板凝集试验结果呈阳性5份、呈阴性2份，阴性样本82份，阳性检出率为25.8%,2种方法的阳性符合率86.1%，且检出率无显著差异（P>0.05），见表1。

表1全自动虎红平板凝集试验与试管凝集试验的结果比对单位：份

3、讨论

布鲁氏菌侵入机体后，能够诱导机体产生相应的免疫应答，体液免疫激活后，产生的抗体广泛存在于血清、乳汁等体液中，不同体液其检测方法有所差异。RBT是血清中布鲁氏菌抗体检测的经典方法，在检测过程中，当血清管抗体浓度过高时，布鲁氏菌与阳性血清凝集可能受到血清中其他离子阻断，会产生高浓度未凝集，而低浓度发生凝集的“前带现象”[9]，另外血清中产生的抗体也能与其他革兰氏阴性菌LPS发生结合，从而产生非特异性凝集[10]，因此RBT检测法假阳性较多，此方法虽省时、便捷，但难以同时兼具较高的准确度、灵敏度和特异度，酸化处理的RBT抗原或血清进会显著减少“带前现象”和非特异性凝集的情况发生，但并不能完全消除假阳性存在的情况。

在本次试验中，全自动虎红平板凝集试验工作站阳性检出率与人工法均检测出阳性样本36份，阴性样本84份，这证实全自动检测法基本可替代人工检测法用于布鲁氏菌抗体的初筛检测，随后在比对了全自动检测结果与试管凝集检测结果后发现，全自动的阳性检出率随高于试管凝集，但二者差异不显著。由于RBT阳性检出率较高，无法区分疫苗抗体或是野毒抗体常作为初筛检测法，因此在临床使用过程中，需要应用准确度和特异度较高的ELISA检测法对阳性样本进行复检[11]。

4、结论

本次试验证实全自动虎红平板凝集试验工作站阳性检出率与人工检出率无显著差异，结果显示该方法具有节省人力，降低检测成本，提高检测效率等优势，表明此方法可替代人工RBT检测法，应用于布鲁氏菌抗体的初筛，为布鲁氏菌病的监控提供便利。

参考文献:

[4]马宪治,何培政.宁夏中卫市沙坡头区牛羊布鲁氏菌病基线调查情况[J].畜牧兽医科学(电子版),2022(12):1-3,24.

[5]刘影,班付国,胡文发,等.河南省平顶山市奶牛布鲁氏菌病流行率及场间传播风险横断面研究[J].中国动物检疫,2020,37(12):22-26,38.

[6]白鹏霞.牛布鲁氏菌病的流行特点及诊断方法研究进展[J].中国动物保健,2023,25(12):3-4.

[7]李林姣,彭小薇,刘铭赫,等.动物布鲁氏菌病实验室检测技术研究进展[J].中国兽药杂志,2023,57(4):78-87.

[8]李树军,张玉龙,马龙,等.虎红平板凝集试验､标准试管凝集试验､酶联免疫吸附方法在布鲁氏菌病中检测的特性及诊断效能[J].中国热带医学,2022,22(11):1 078-1 081.

文章来源:朱涛.布鲁氏菌全自动检测法的可行性分析[J].现代畜牧科技,2024(05):39-41.