心室重构是在细胞内、外信号如机械信号[1]、神经内分泌[2]、代谢[3]以及炎症信号[4-5]综合作用下出现的以应激损伤、能量代谢障碍、钙稳态失调为特征的病理生理过程，其是高血压、冠心病、心脏瓣膜病、心肌病、糖尿病、结缔组织病等多种全身性疾病共同作用于心脏的并发症，是心力衰竭发生的前奏和基础[6]。心室重构的发生机制包括炎症反应及炎性因子刺激[7]、心肌细胞氧化还原状态的改变[8]、自噬及细胞凋亡[9]等。心肌组织肾素-血管紧张素系统的变化对心室重构发生和发展起着至关重要的作用。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可以促进动脉血管收缩、诱导肾上腺皮质球状细胞合成和释放醛固酮、促进肾小管对钠离子的重吸收、通过交感神经末梢突触前膜的正反馈促使去甲肾上腺素的分泌等作用来升高血压，通过机械牵张作用和增加心脏后负荷而引起心室重构[10]。Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白，在个体生长代谢、组织发育、体细胞重编程和肿瘤发生中发挥重要作用[11]。Lin28可抑制细胞凋亡，通过增强线粒体功能而减轻炎症损伤、氧化应激，降低高糖、高脂状态下心肌细胞缺氧复氧损伤[12]。一项糖尿病大鼠缺血再灌注模型研究显示，Lin28过表达可缩小心肌梗死面积、改善心脏功能、减少心肌细胞凋亡、减轻线粒体损伤[13]。Lin28可以选择性地抑制或阻断多种分子、抑制细胞凋亡、减轻病理损伤性心功能障碍。因此，Lin28可能是抑制心室重构的一个重要靶点。本研究旨在探讨Lin28对AngⅡ诱导的心室重构细胞模型的影响。

1、材料与方法

1.1实验时间

本实验时间为2022年10月—2023年8月。

1.2实验动物

出生1～3 d的C57BL/6小鼠10只，雄性，购于中国人民解放军空军军医大学实验动物中心。

1.3实验材料

Lin28-cDNA腺病毒、Lin28-siRNA腺病毒、GFP-LC3腺病毒购自汉恒生物科技(上海)有限公司；兔抗小鼠Lin28多克隆抗体、兔抗小鼠β-action多克隆抗体、兔抗小鼠P62多克隆抗体、兔抗小鼠Beclin 1多克隆抗体购自英国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)检测试剂盒、白介素(interleukin，IL)-6检测试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)购自西安科昊生物工程有限公司；AngⅡ由西安晨诺生物科技有限公司提供，来自Merck公司。

1.4实验方法

1.4.1乳鼠原代心室肌细胞(neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCMs)培养

从出生1～3 d的C57BL/6小鼠的心室分离NMVCMs，将其铺在共聚焦培养皿上，在含95% O2和5% CO2的37℃培养箱内培养。

1.4.2实验分组

将NMVCMs分为阴性对照组、AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组、AngⅡ+Lin28下调组。阴性对照组加入PBS；AngⅡ对照组加入AngⅡ(10μmol/L)并孵育24 h以构建心室重构模型；AngⅡ+Lin28过表达组转染Lin28-cDNA腺病毒36 h，之后加入AngⅡ(10μmol/L)并孵育24 h；AngⅡ+Lin28下调组转染Lin28-siRNA腺病毒36 h，之后加入AngⅡ(10μmol/L)并孵育24 h。

1.4.3酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测TNF-α、IL-6

收集四组对数生长期NMVCMs，以2 000 r/min离心20 min(离心半径15 cm)，收集上清液。实验设3个孔：空白孔、标准孔、待测样品孔。按照说明书对标准品稀释与加样，即向酶标包被板的待测样品孔吸入待测样品10μl、样品稀释液40μl。加完样品后，轻微摇动以便液体充分混合。在常温条件下使用封板膜封板，然后设置温度为37℃并温育30 min。稀释浓缩的洗涤液，用蒸馏水稀释30倍。缓慢去掉封板膜，将其中的液体吸弃。然后使用稀释的洗涤液清洗5次，然后拍干。将酶标试剂加入标准孔及待测样品孔中，每孔约50μl。再次进行温育及洗涤操作，方法同上。加显色剂：依次加入A剂50μl、B剂50μl，稍微摇动以便液体充分混合。于37℃条件下显色15 min。向各孔中加入50μl的终止液。可以观察到颜色由蓝色转变成黄色。测量450 nm波长处吸光度(OD值)。实验重复3次。

1.4.4 TUNEL法检测细胞凋亡率

收集四组对数生长期NMVCMs，采用4%多聚甲醛溶液室温固定10 min，采用PBS清洗2次；再采用0.2% Triton X-100通透细胞10 min，采用PBS清洗2次；每个爬片滴加底物15μl，室温孵育至少10 s；滴加TdT Enzyme工作液11μl于爬片上，于湿盒中37℃孵育1 h；加入漂洗缓冲液并振荡15 s后室温孵育10 min，采用PBS清洗3次；滴加荧光素工作液13μl，湿盒中室温避光孵育30 min，采用PBS清洗4次；采用4，6-联脒-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)封固，荧光显微镜下(×200)观察、拍照。细胞核为蓝色荧光，凋亡细胞为红色荧光。每组随机观察10个视野并计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.4.5免疫荧光法检测GFP-LC3荧光点数

收集四组对数生长期NMVCMs，使用胰酶+乙二胺四乙酸消化液进行消化，800 r/min离心5 min(离心半径15 cm)，去掉上清液，加入2 ml培养基并重悬细胞，吹打使细胞成为细胞悬液，当细胞生长良好，且密度达到60%以上时转染GFP-LC3腺病毒(1×1010PFU/ml)24 h。使用荧光显微镜(×40)观察各组GFP-LC3荧光点数，细胞骨架为红色荧光、细胞核为蓝色荧光。每组随机拍摄5个视野，计算GFP-LC3荧光点数，取平均值。实验重复3次。

1.4.6 Western blotting法检测P62、Beclin1表达水平

收集四组对数生长期NMVCMs并加入120～200 U RIPA裂解液，使用细胞刮刀对瓶底细胞进行刮擦，使每个细胞发生裂解，每10 min作用一次，一共作用3次，细胞裂解后，12 000 r/min离心20 min(离心半径15 cm)，取上清液，采用BCA法测定总蛋白浓度。使用10%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)将组织裂解产物进行电泳，然后转移到PVDF膜上，再使用5%脱脂牛奶封闭2 h。4℃孵育一抗过夜，37℃孵育二抗1 h，使用双色红外成像系统进行扫描分析，采用Quantity One软件计算P62、Beclin1表达水平。

1.5统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计量资料以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 TNF-α、IL-6

四组TNF-α、IL-6比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组、AngⅡ+Lin28下调组TNF-α、IL-6高于阴性对照组，AngⅡ+Lin28过表达组TNF-α、IL-6低于AngⅡ对照组，AngⅡ+Lin28下调组TNF-α、IL-6高于AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

注：TNF-α=肿瘤坏死因子α，IL-6=白介素6，AngⅡ=血管紧张素Ⅱ；a表示与阴性对照组比较，P<0.05；b表示与AngⅡ对照组比较，P<0.05；c表示与AngⅡ+Lin28过表达组比较，P<0.05。

表1四组TNF-α、IL-6比较(±s，n=3，pg/ml)

2.2细胞凋亡率

阴性对照组细胞凋亡率为(9.0±1.7)%，AngⅡ对照组为(28.9±1.6)%，AngⅡ+Lin28过表达组为(14.1±2.1)%，AngⅡ+Lin28下调组为(53.5±3.2)%，差异有统计学意义(F=546.70，P<0.001)；其中AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组、AngⅡ+Lin28下调组细胞凋亡率高于阴性对照组，AngⅡ+Lin28过表达组细胞凋亡率低于AngⅡ对照组，AngⅡ+Lin28下调组细胞凋亡率高于AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 GFP-LC3荧光点数及P62、Beclin 1表达水平

四组GFP-LC3荧光点数及P62、Beclin 1表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组GFP-LC3荧光点数、Beclin 1表达水平高于阴性对照组，P62表达水平低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；AngⅡ+Lin28过表达组GFP-LC3荧光点数、Beclin 1表达水平高于AngⅡ对照组，P62表达水平低于AngⅡ对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；AngⅡ+Lin28下调组GFP-LC3荧光点数、Beclin1表达水平低于阴性对照组、AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组，P62表达水平高于阴性对照组、AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图1～2。

3、讨论

心室重构是心力衰竭发生的前奏和基础。临床上，采用血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和醛固酮受体拮抗剂抗心室重构取得一定效果[14]，然而，上游信号分子间存在的复杂的交互作用和反馈调节网络系统导致上述针对单一细胞膜受体或者通道受体的治疗效果仍然有限[15-16]。

Lin28在心血管疾病发生发展中起非常重要的作用。2011年ZHU等[17]首次揭示了Lin28在葡萄糖代谢中的作用，指出Lin28过表达可激活Insulin/PI3K/mTOR通路，抑制let-7及其下游基因的表达，增加葡萄糖摄取及提升胰岛素敏感性。而下调Lin28的表达可加剧胰岛素抵抗及减少葡萄糖摄取[18]。

注：a表示与阴性对照组比较，P<0.05；b表示与AngⅡ对照组比较，P<0.05；c表示与AngⅡ+Lin28过表达组比较，P<0.05。

表2四组GFP-LC3荧光点数及P62、Beclin 1表达水平比较(±s，n=3)

图1四组GFP-LC3荧光点数(免疫荧光法，×40)

炎症在心室重构中发挥重要作用[19]。研究显示，心室重构小鼠模型的心肌组织以及临床心室重构患者血浆中炎性因子(如IL-26、TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平均明显升高[7]。心室重构时巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等炎性细胞在心肌组织内及其周边大量聚集，这可诱发细胞内促炎信号通路的激活以及神经体液炎性因子的大量释放，导致心肌局部的炎症反应，进而启动和加速心室重构的发生发展[20]。本研究结果显示，AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组、AngⅡ+Lin28下调组TNF-α、IL-6高于阴性对照组，AngⅡ+Lin28过表达组TNF-α、IL-6低于AngⅡ对照组，AngⅡ+Lin28下调组TNF-α、IL-6高于AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组，提示AngⅡ诱导的心室重构细胞模型存在炎症反应，而Lin28过表达可减轻炎症反应，在一定程度上阻止心室重构的发展；下调Lin28表达又可加重炎症反应，说明Lin28可通过减轻炎症反应而发挥抑制心室重构的作用。

在遭受慢性病理性刺激的心脏中，持续发生的心肌细胞凋亡被视为促进心室重构的重要因素[21]。研究显示，心肌缺血或者心脏负荷过重时，细胞因子通过升高活性氧水平或者调控G蛋白偶联受体信号通路来诱发心肌细胞凋亡，导致心室重构[22]。本研究结果显示，AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组、AngⅡ+Lin28下调组细胞凋亡率高于阴性对照组，AngⅡ+Lin28过表达组细胞凋亡率低于AngⅡ对照组，AngⅡ+Lin28下调组细胞凋亡率高于AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组，提示AngⅡ诱导的心室重构细胞模型心肌细胞凋亡率增加，而Lin28过表达能降低心肌细胞凋亡率，且降低Lin28又可增加心肌细胞凋亡率，说明Lin28可通过减少心肌细胞凋亡发挥抑制心室重构的作用。

图2 Western blotting法检测四组P62、Beclin 1表达水平的电泳图

自噬在心室重构中发挥着重要作用。自噬能够通过清除受损的细胞器、胞质内大分子以及长寿蛋白来加速细胞内物质循环，改善受损细胞的能量状态，从而抑制外来刺激引发的心室重构[9，23]。在心室重构的发生发展过程中，自噬代表了心肌应对压力状态的一种自我适应性的代偿性机制，以抑制各种病理生理刺激所诱发的心室重构[22，24]。LC3是自噬过程中非常重要的一个蛋白，其参与自噬形成的全过程，而采用GFP-LC3腺病毒感染细胞，加入自噬诱导剂后，根据荧光共定位情况，可以检测出自噬体[25]。P62能和自噬底物相结合，然后进入溶酶体降解的蛋白中，因而P62表达水平升高提示自噬底物并未得到有效降解，这会抑制自噬活性。Beclin 1也是自噬过程中的蛋白，其在体内磷酸化后可促进自噬蛋白定位到自噬泡，其表达水平升高提示自噬增加[26]。本研究结果显示，AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组GFP-LC3荧光点数、Beclin 1表达水平高于阴性对照组，P62表达水平低于阴性对照组；AngⅡ+Lin28过表达组GFP-LC3荧光点数、Beclin 1表达水平高于AngⅡ对照组，P62表达水平低于AngⅡ对照组；AngⅡ+Lin28下调组GFP-LC3荧光点数、Benclin 1表达水平低于阴性对照组、AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组，P62表达水平低于阴性对照组、AngⅡ对照组、AngⅡ+Lin28过表达组；提示AngⅡ诱导的心室重构细胞模型自噬增强，Lin28过表达能提高心肌细胞自噬水平，而下调Lin28表达又可降低心肌细胞自噬水平，说明Lin28可通过增强心肌细胞自噬而发挥抑制心室重构的作用。

4、结论

综上所述，Lin28可减轻AngⅡ诱导的心室重构细胞模型炎症反应、减少心肌细胞凋亡、增强心肌细胞自噬。但心室重构的发生发展过程涉及多种神经、体液生理病理因素及多条信号传导通路与众多信号分子，Lin28上游及下游因子是否参与其发生发展尚不明确，还需进一步深入研究。此外，本研究仅局限于细胞水平，后续将开展动物实验以进一步验证本研究结论。

作者贡献：酉鹏华进行文章的构思与设计，论文撰写及修订，负责文章的质量控制及审校；尤红俊进行研究的实施与可行性分析，资料收集、整理，统计学处理，对文章整体负责、监督管理。

参考文献:

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[25]闫莉,杨光,程功.香芹酚通过增强PTEN诱导激酶1/Parkin介导的自噬而减轻心肌缺血再灌注损伤的动物及细胞实验[J].实用心脑肺血管病杂志,2021,29(11):69-78..

[26]王婷婷,张鹏珂,史敏,等.异鼠李素通过上调自噬水平预防巨噬细胞脂质代谢紊乱[J].实用心脑肺血管病杂志,2023,31(9):70-73.

基金资助:陕西省自然科学基金资助项目(2022JM-540);

文章来源:酉鹏华,尤红俊.Lin28对血管紧张素Ⅱ诱导的心室重构细胞模型的影响[J].实用心脑肺血管病杂志,2024,32(08):68-73.