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检测分析胆酸类成分的牛胆粉质量控制与掺伪现状

2020-07-20 727 上传者：管理员

摘要：目的建立基于胆酸类成分的牛胆粉质量控制方法,对市售牛胆粉的质量进行评价,分析可能存在的掺伪情况。方法建立同时测定牛、羊、猪、鸡、鸭等动物胆粉中胆酸类成分含量的方法,对自制样品与企业收集样品分别进行研究,以自制样品为主要依据,考察牛胆粉与猪、羊等动物胆粉的差异及含量规律,评价企业收集样品的质量及可能存在的掺伪情况。结果建立了HPLC-ELSD法同时测定牛、羊、猪、鸡、鸭等动物胆粉中12种胆酸类成分含量的方法。分析23批自制动物胆粉的测定结果,明确了牛胆粉与其他动物胆粉中胆酸类成分的含量差异;分析23批企业收集牛胆粉样品的测定结果,发现了牛胆粉中可能掺杂羊胆粉、胆酸下脚料两种主要掺伪情况。23批企业收集样品中仅8批符合规定,合格率仅34.8%,品种质量亟须加强提升和监管。结论研究建立的方法可有效控制牛胆粉的质量,识别牛胆粉中可能存在的掺伪情况,为提高牛胆粉的质量标准及加强市场监管提供了参考和依据。

关键词：
常用药材
掺伪检测
有害残留物研究
牛胆粉
胆酸类成分
质量控制
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牛胆粉由新鲜牛胆汁经干燥、粉碎等加工过程制得,历代本草均有记载,具有除心腹热、渴、利,口焦躁,益目睛的功效,是传统中医及蒙医的常用药材。据市场调研,牛胆粉目前主要作为生产人工牛黄的原料,年需求量约100吨,是决定人工牛黄药效的关键原料,其质量好坏直接影响人工牛黄的质量优劣。牛胆粉现收载于《中国药典》2015年版一部(质量标准收载于“人工牛黄”原料部分)[1],质量标准收载的质控项目专属性较差,如含量测定采用糠醛显色-紫外分光光度法测定总胆酸的含量,难以体现牛胆粉中结合型胆酸与游离型胆酸的含量差异,更无法鉴别牛胆粉中掺杂其他动物胆粉及胆酸下脚料等情况,是造成牛胆粉及人工牛黄产业质量问题频发的重要原因之一。

胆酸类成分是动物胆汁中具有相同胆烷酸母核结构成分的统称,依据脂肪侧链取代基的不同,可大致分为结合型胆酸(牛磺酸或甘氨酸取代基)和游离型胆酸(羟基取代基),常见的结合型胆酸有:牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺猪去氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸等;游离型胆酸有胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸等。胆酸类成分缺少共轭结构,紫外吸收弱,HPLC-UV法测定仅能使用末端吸收[2,3,4],方法的灵敏度和专属性不佳,因此多采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)的含量测定方法,但现有文献[5,6,7,8,9]报道多集中在某一种动物胆汁或胆粉的测定,且测定的胆酸类成分种类较少,未能覆盖牛胆粉中主要含有的结合型胆酸及游离型胆酸,缺乏对多种动物胆粉中胆酸类成分的同时测定研究。因此现有的文献方法难以用于牛胆粉中可能存在的掺伪检测研究。本实验采用HPLC-ELSD法,对牛、羊、猪等动物胆粉中的胆酸类成分进行系统研究,建立基于胆酸类成分的牛胆粉质量控制方法,并对市售牛胆粉的质量进行评价,分析可能存在的掺伪情况。

1、仪器与材料

仪器:Agilent 1100液相色谱仪(美国Agilent公司,包括四元泵,自动进样器,蒸发光散射检测器);SK8210LHC型超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司);5430R离心机(德国Eppendorf公司)。

对照品及试剂:胆酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号100078-201415);牛磺胆酸钠对照品(中国食品药品检定研究院,批号110815-201510);去氧胆酸对照品(美国ChromaDEx公司,批号00004151-168);猪去氧胆酸对照品(加拿大TRC公司,批号19-GHZ-15-1);鹅去氧胆酸对照品(加拿大TRC公司,批号1-TTK-64-1);牛磺去氧胆酸钠对照品(加拿大TRC公司,批号8-JTN-91-1);甘氨胆酸对照品(加拿大TRC公司,批号1-NYL-118-1);牛磺猪去氧胆酸对照品(加拿大TRC公司,批号7-RNP-115-2);甘氨猪去氧胆酸对照品(加拿大TRC公司,批号24-CF-57-3);牛磺鹅去氧胆酸对照品(加拿大TRC公司,批号29-GHZ-67-1);甘氨鹅去氧胆酸对照品(加拿大TRC公司,批号25-SSR-180-1);甘氨去氧胆酸对照品(美国Matrix Scientific公司,批号U23R);甲醇、三氟乙酸为分析纯;乙腈为色谱纯;Millipore超纯水。

样品的收集情况见表1,包括23批自制动物胆粉及23批企业收集的牛胆粉。

表1 46批样品中12种胆酸类成分的含量测定结果.%

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为ACCHROM XAqua C18(柱长为25 cm,柱内径为4.6 mm,粒径为5μm);柱温35℃,蒸发光散射检测器漂移管温度80℃,氮气流速1.6 L·min-1;以乙腈为流动相A,0.2%三氟乙酸溶液为流动相B,流速1.0 mL·min-1,梯度洗脱条件为0～30 min,25%～52% A;30～45 min,52% A;进样体积:对照品溶液2、5、10、20μL;供试品溶液10μL。代表性的色谱图见图1。

2.2溶液的制备

2.2.1供试品溶液的制备

取胆粉样品约100 mg,精密称定,置50 mL量瓶中,加甲醇适量,超声处理(500 W,53 kHz)30 min,放冷,加甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液即得。

2.2.2对照品溶液的制备

取胆酸类成分对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL各含0.15～0.3 mg的混合溶液,即得。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液2、5、10、20μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,以进样量(μg)的对数值为横坐标,峰面积的对数值为纵坐标,绘制标准曲线,线性方程及相关系数见表2,结果表明,12种胆酸类成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.2精密度实验

精密吸取胆酸类成分的混合对照品溶液10μL,连续进样6次,测得12种胆酸类成分峰面积的RSD在0.72%～1.98%之间,结果表明,仪器精密度良好。

2.3.3重复性实验

取牛胆粉样品(自编号NDF2)、猪胆粉样品(XDF1)、鸡胆粉样品(JDF1)及羊胆粉样品(YDF1),按“2.2.1”项下方法制备6份供试品溶液,依法测定并计算,结果12种胆酸类成分含量RSD在0.44%～2.47%之间,表明重复性良好。

2.3.4稳定性实验

取“2.3.3”项下的供试品溶液,分别于制备后的0、4、8、12、16、20、24 h进样分析,记录峰面积,12种胆酸类成分的峰面积RSD在2.4%～5.2%之间,结果表明,供试品溶液在24 h内基本稳定。

图1混合对照品溶液(A)、牛胆粉供试品溶液(B)、羊胆粉供试品溶液(C)、猪胆粉供试品溶液(D)、鸡胆粉供试品溶液(E)和胆酸下脚料供试品溶液(F)色谱图

表2 12种胆酸类成分的线性范围、线性回归方程及相关系数

2.3.5加样回收率实验

取牛胆粉样品(自编号NDF2)约50 mg,精密称定,一式9份,分别加入低、中、高3种浓度水平的胆酸类成分对照品,每个浓度水平一式3份,按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液,进行加样回收率实验,回收率结果见表3,12种胆酸类成分的加样回收率在96%～102%之间,结果表明,方法准确度良好。

2.3.6样品测定

按“2.2.1”项下的方法,对收集的46批样品依法制备并测定,结果见表1,各胆酸类成分的仪器检出限(3倍信噪比)在20～50 ng,结合检测方法(称取100 mg样品,定容至50 mL,取10μL进样),以50 ng仪器检出限折算至方法检出限为0.25%,因此表中结果标示为“ND”均为未检出(检出限0.25%)。

对自制动物胆粉的测定结果,分别从结合型胆酸、游离型胆酸的种类和含量两方面汇总,结果见表4,5。

3、讨论

3.1关于12种胆酸类成分的色谱分离

所建方法为蒸发光散射(通用型检测器)检测法,通用型检测器对待测组分的选择性较差,因此12种胆酸类成分色谱峰的基线分离是准确定量及掺伪检测的前提,方法对色谱柱的分离能力要求较高。方法开发过程中发现,多数文献[5,6,7,8,9]报道使用的色谱柱如Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)、Waters Xselect HSS T3-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)、Waters Symmetry Shield RP18(4.6 mm×250 mm, 5μm)、Phenomenex Luna2-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)等无法满足本实验要求,难以兼顾两组胆酸类成分(牛磺胆酸与牛磺猪去氧胆酸、去氧胆酸与鹅去氧胆酸)的色谱峰基线分离。因此现有文献报道的方法可以用于测定某一种或几种动物胆粉中的胆酸类成分,但难以用于牛胆粉的掺伪检测研究。

表3 12种胆酸类成分的加样回收率实验结果. n=9

表4自制胆粉样品中结合型胆酸的含量范围.%

表5自制胆粉样品中游离型胆酸的含量范围.%

3.2自制动物胆粉样品中胆酸类成分的含量分析

对于自制动物胆粉的测定结果,可得出如下规律:①正常的动物胆粉中,胆酸类成分以结合型胆酸为主(多数>50%),游离型胆酸占比较小(<7%);而胆酸下脚料则正好相反,以游离型胆酸为主,结合型胆酸的量极小。如牛、羊胆粉以牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨胆酸及甘氨去氧胆酸为主,含量在50%以上;鸡、鸭胆粉以牛磺鹅去氧胆酸为主;猪胆粉以甘氨猪去氧胆酸为主。因此若某胆粉样品中游离型胆酸的量很高,超过了结合型胆酸的含量比例,可怀疑胆汁变质或是否添加了胆酸类下脚料。②牛、羊胆粉与猪、鸡鸭胆粉相比,结合型胆酸的种类存在显著差异。牛、羊与猪、鸡、鸭的种属差异较大,牛、羊胆粉以牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨胆酸及甘氨去氧胆酸4种结合型胆酸为主,猪、鸡、鸭胆粉中基本不含有以上4种结合型胆酸,据此特点,可区分牛、羊胆粉与鸡、鸭、猪胆粉。③牛胆粉与羊胆粉相比,牛胆粉中甘氨胆酸的含量明显高于羊胆粉。牛、羊由于种属及生活习性较为接近,两者所含结合型胆酸的种类基本一致,但牛胆粉中甘氨胆酸(15.6%～30.5%)的含量显著高于羊胆粉(0～3.7%),而羊胆粉中牛磺胆酸的含量一般高于牛胆粉。据此可以区分牛胆粉与羊胆粉。

3.3企业收集样品中胆酸类成分的含量分析

根据以上规律,分析23批企业收集样品的测定结果,考察各样品中胆酸类成分的含量特点,可将23批牛胆粉的质量情况大概分为以下5类,见表6,发现了4种疑似掺伪情况,主要以掺入胆酸下脚料或掺入羊胆粉为主。23批样品中仅有8批样品符合规定,表明市售牛胆粉的质量不容乐观,侧面印证了近年来人工牛黄产业质量问题频发、劣币驱逐良币的现象。

3.4牛胆粉质量标准的增修订建议

根据本实验的结果,建议牛胆粉的质量标准中可增订以下质控项目,见表7,既能控制自身的品种质量,又能防止其他动物胆粉及胆酸下脚料等掺伪情况。

表6 23批市售牛胆粉样品的质量情况分析

表7建议增订的牛胆粉质控项目

基金:上海市科学技术委员会项目资助(18DZ2292200,19DZ2202800);国家药典委员会人工牛黄及制剂质量标准研究专项资助.

曹帅,夏晶,付泽晓,李家豪,李丽敏,胡文言,胡青,毛秀红,季申.基于胆酸类成分的牛胆粉质量控制与掺伪检测研究[J].中国药学杂志,2020,55(05):383-388.