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高效液相色谱法检查醋酸阿托西班注射液中的6个杂质

2024-12-18 34 上传者：管理员

摘要：目的检查醋酸阿托西班注射液中潜在的二聚体杂质（Z35）等6个杂质。方法采用飞诺美Phenomenex Gemini C18 110A（4.6 mm×250 mm，3 μm）色谱柱，流动相A为乙腈-甲醇-溶液Ⅰ（取纯水2000 mL，用三氟乙酸调pH至3.2）(15∶10∶75)，流动相B为乙腈-甲醇（60∶40），进行梯度洗脱，柱温60℃，流速1.2 mL•min-1，检测波长220 nm。结果在该色谱条件下，6个杂质分离度符合要求，且空白溶液不干扰各杂质的检出；滤膜对杂质均无明显吸附作用；阿托西班及各杂质在50%～150%的限度浓度范围内与峰面积线性关系良好；各杂质的定量限和检测限均小于限度浓度水平，符合检测要求；重复性6份样品的各单杂和总杂含量变化绝对值均小于限度值的20%，符合精密度要求；加样回收率结果均在80%～120%内，方法准确度良好；供试品溶液及对照溶液在室温条件下放置24 h，各杂质检出无明显变化。结论该方法简便、可行，可用于醋酸阿托西班注射液中有关物质检查。

关键词：
HPLC法
催产素拮抗药
缩宫素受体
聚体杂质
醋酸阿托西班注射液
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醋酸阿托西班注射液为催产素拮抗药，阿托西班通过与缩宫素受体特异性结合，对人催产素产生竞争性抑制作用，从而抑制宫缩，有较好的临床效果。由于其为唯一具有子宫特异性的宫缩抑制剂，对心血管方面的影响少，不良反应发生率低于其他宫缩抑制剂，已被英国皇家妇产科学院推荐作为抗早产的一线药物。因此，醋酸阿托西班注射液是治疗先兆早产安全且有效的药物，值得在临床推广应用[1]。

依据国家药品监督管理局药品审评中心发布的《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》[2]及《化学药物杂质研究技术指导原则》[3]，对药物的工艺杂质及潜在降解杂质进行深入透彻的剖析及研究，以确保产品的安全性。

目前，国内对醋酸阿托西班注射液有关物质检测方法的研究比较少[4-5]，且未对该方法进行全面的方法学验证。考虑到醋酸阿托西班注射液中可能存在制剂过程中产生的降解杂质以及来源于原料药的工艺杂质，因此，本文在进口药品注册标准(标准号：JX20110002)[6]的基础上，结合已上市品种注册标准(YBH02152019)[7]，对醋酸阿托西班注射液以下几个杂质进行研究，具体的杂质谱分析见图1。

图1醋酸阿托西班注射液杂质谱分析

1、仪器与试药

1.1仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪(安捷伦)；S220酸度计、XSE205十万分之一电子天平(美国梅特勒-托利多公司)。

1.2试药

乙腈、甲醇(色谱纯，默克公司)，三氟乙酸、冰乙酸(分析纯，国药化学试剂有限公司)；醋酸阿托西班注射液(批号：73191201、73191202、73200901，扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司)；醋酸阿托西班对照品(批号：RS1912010，肽含量：91.93%)、杂质Z35(批号：200501，肽含量：82.68%)(上海苏豪逸明有限公司)；杂质Z14(批号：19110007，纯度：95.57%)、杂质Z1(批号：020170809，肽含量：84.74%)、杂质Z44(批号：D2014092601，纯度：72.97%)；杂质Z41(批号：D20140317，纯度：89.29%)、杂质Z43(批号：D2014101603，纯度：89.8%)(哈尔滨吉象隆生物技术有限公司)。

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18110A(4.6 mm×250 mm，3μm)；流动相A为乙腈-甲醇-溶液Ⅰ(取纯水2000 mL，用三氟乙酸调pH至3.2)(15∶10∶75)，流动相B为乙腈-甲醇(60∶40)，按表1进行梯度洗脱；柱温为60℃，流速为1.2 mL·min-1，检测波长为220 nm，进样量为25 µL。

表1梯度洗脱程序

2.2溶液配制

2.2.1空白溶液(稀释液)

即溶液Ⅰ。

2.2.2系统适用性溶液

分别取醋酸阿托西班对照品和阿托西班各杂质适量，用稀释液溶解稀释制成每1 mL中分别含阿托西班约0.6 mg，含Z14、Z41各约1.2μg，含Z1约1.8μg，含Z44约2.4μg，含Z35约1.8μg，含Z43约3.0μg的混合溶液。

2.2.3供试品溶液

精密移取醋酸阿托西班注射液2 mL，置25 mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4对照溶液

精密移取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.2.5灵敏度溶液

精密移取对照溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液。

2.2.6乙酸定位溶液

取乙酸约60 mg，置100 mL量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为醋酸定位溶液。

2.2.7空白辅料溶液

精密称取甘露醇约0.1 g，置烧杯中，加水适量使溶解，用盐酸调节pH至4.5，转移至25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。

2.2.8各杂质定位溶液

分别精密称定Z35、Z14、Z1、Z44、Z41及Z43杂质约0.003 g，置于相应的50 mL量瓶中，用适量稀释液溶解并稀释至刻度，再分别量取3、2、3、4、2、5 mL溶液置100 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为各杂质定位溶液。

2.3方法学验证

2.3.1专属性

取“2.2”项下方法配制的空白溶液、空白辅料溶液、系统适用性溶液各25 µL，分别进样测定，记录色谱图。结果见图2～4，空白溶液不干扰各杂质和主成分检测。Z14与阿托西班的分离度为3.47，Z1与阿托西班分离度为2.90，表明方法专属性良好。

图2系统适用性溶液HPLC图谱

图3空白溶液HPLC图谱

图4空白辅料溶液HPLC图谱

2.3.2滤膜吸附试验

采用直径为25 mm的聚四氟乙烯滤膜过滤，供试品溶液分别过滤0、2、4、6 mL后，相对控制样品主峰面积的回收率分别为99.7%、99.9%、100.0%、100.0%；其中Z1、Z44、Z43均无变化，Z14+Z38的最大变化绝对值为0.01%(≤0.04%)，Z41的最大变化绝对值为0.01%(≤0.04%)、Z35的最大变化绝对值为0.03%(≤0.06%)，其他最大未知单杂的最大变化绝对值为0.02%(≤0.02%)，其他杂质总量(除Z14+Z38、Z1外)的RSD为4.2%。因此，采用聚四氟乙烯滤膜进行过滤，对供试品溶液无影响。各杂质检测结果见表2。

表2滤膜吸附试验杂质结果(%)

2.3.3检测限与定量限

取醋酸阿托西班、Z35及其他杂质的对照品储备液，用稀释液逐级稀释后进样，记录信噪比S/N约为3∶1的量即为检测限，S/N约为10∶1的量即为定量限。结果见表3。

表3检测限及定量限结果

2.3.4标准曲线制备

精密称取醋酸阿托西班、Z35及各杂质对照品适量，加稀释液溶解，分别配制成相当于限度浓度的20%、50%、100%、150%、200%、500%，并以定量限溶液浓度和峰面积作为试验最低点，以进样浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。结果见表4。

表4标准曲线结果

2.3.5杂质的校正因子

根据线性回归方程，按照以下公式计算各杂质的校正因子：校正因子=醋酸阿托西班主成分标准曲线斜率/各杂质标准曲线斜率。各杂质的校正因子见表4。

2.3.6精密度

照“2.2”项下方法配制空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液(平行配制6份)、灵敏度溶液、对照溶液、醋酸定位溶液，精密量取上述溶液各25 µL，注入色谱仪，记录色谱图。6份供试品溶液校正后Z14+Z38含量之和为0.05%～0.06%，含量变化绝对值为0.01%(≤0.04%)；Z1、Z44均未检出；Z41含量为0.03%～0.04%，含量变化绝对值为0.01%(≤0.04%)；Z35含量为0.01%～0.02%，含量变化绝对值为0.01%(≤0.06%)；Z43含量均为0.11%；其他最大单杂为含量0.02%～0.03%，含量变化绝对值为0.01%(≤0.02%)；除Z14、Z38、Z1外其他杂质总量为0.20%～0.23%，含量变化绝对值为0.03%(≤0.30%)，结果均符合规定，表明本法精密度良好。

2.3.7准确度

分别选择醋酸阿托西班注射液各杂质的50%、100%、150%的浓度水平作为回收试验溶液。结果三个浓度下，Z14的平均回收率分别为96.6%、96.2%、95.4%，RSD分别为1.3%、0.91%、0.18%；Z44的平均回收率分别为100.6%、101.5%、102.7%，RSD分别为0.55%、1.4%、2.1%；Z41的平均回收率分别为100.2%、101.2%、103.0%，RSD分别为0.71%、1.8%、1.7%；Z1的平均回收率分别为101.1%、102.1%、102.6%，RSD分别为2.4%、1.2%、0.48%；Z43的平均回收率分别为93.9%、93.1%、97.9%，RSD分别为0.59%、0.86%、1.5%；Z35的平均回收率分别为为103.7%、109.4%、108.7%，RSD分别为9.4%、0.19%、1.4%。表明方法准确度良好。

2.3.8溶液稳定性

照“2.2”项下方法配制供试品溶液、对照溶液，分别精密量取常温条件下存放0、2、4、8、12、16、20、24 h的对照溶液和供试品溶液各25 µL进样检测，记录色谱图。在室温条件下，对照溶液及供试品溶液在24 h内各时间点主峰峰面积与0 h主峰峰面积的百分比在99.9%～100.9%，各时间点供试品溶液检出Z14+Z38、Z41、最大未知单杂、除Z14、Z38、Z1外的其他杂质总量最大变化绝对值分别为0.01%、0.01%、0.01%、0.02%，Z44、Z1均未检出，Z35均为0.01%，Z43均为0.11%。结果表明，供试品溶液和对照溶液均在室温下存放24 h内稳定。

2.3.9样品中有关物质的测定

采用“2.1”项下检测方法，对3批醋酸阿托西班注射液产品进行测定，结果各批样品的单杂和总杂均在限度范围之内，见表5。

3、讨论

3.1方法来源

醋酸阿托西班注射液进口药品注册标准(标准号：JX20110002)[6]中有关物质的检测方法为HPLC法，色谱条件为常见的反相梯度洗脱法，色谱柱、试剂均为常见易得，该标准中采用加校正因子的主成分自身对照法，并记载了各杂质的校正因子，因此方法简单可行，为行业内常见的方法。故本文采用了进口药品注册标准中有关物质检测方法，并根据《中国药典》通则中分析方法验证指导原则的要求，对醋酸阿托西班注射液的关键工艺杂质(Z14、Z38、Z1、Z35)和关键降解杂质(Z44、Z41、Z43)进行方法学验证，以确认该方法在现有试验条件下检测醋酸阿托西班注射液有关物质的适用性，并确定各杂质的校正因子。

表5多批样品检测结果(%)

3.2 Z14与Z38

在专属性及系统适用性试验的研究中发现，Z14和Z38出峰时间基本一致，故本项研究结果与进口药品注册标准中将两个杂质一并订入标准按照一个杂质峰进行控制的要求保持一致。因此，本文中后续其他验证项目只选取Z14作为Z14和Z38的代表杂质进行研究。

3.3 Z14

由本研究结果可知，Z14与阿托西班的分离度为3.47，符合进口药品注册标准中分离度的要求(应不小于1.2)，同时符合《中国药典》通则中分离度的要求(应不小于1.5)，说明在现有试验条件下，该检测方法的系统适用性良好。

图5阿托西班二聚体杂质(Z35)的产生途径

3.4二聚体杂质Z35

醋酸阿托西班为多肽类药物，由于醋酸阿托西班在光照条件下二硫键活化为硫自由基，然后发生分子间聚合反应生成二聚体，因此二聚体为该产品潜在的杂质。本文选取潜在的二聚体杂质MPr-D-Tyr(OET)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2，环肽(Z35)进行了研究，该杂质含两对二硫键，MPr与Cys和Cys与Mpr。其杂质产生途径如图5所示。

在一项关于液质联用技术用于醋酸阿托西班注射液中杂质结构鉴定[8]的研究中，采用高效液相色谱、超高效液相色谱-四极杆串联静电场轨道阱高分辨质谱技术可有效鉴定出阿托西班二聚体杂质，可为本文的二聚体杂质Z35进行结构鉴定提供参考依据。

由于阿托西班Z35为工艺杂质，且未收录在进口药品注册标准中；本次方法学验证结果显示，本法能准确检测Z35，因此，本次研究结果可作为提升醋酸阿托西班注射液质量标准的依据。

4、结论

本文参照进口药品注册标准(标准号：JX20110002)中记载的有关物质检测方法，对醋酸阿托西班注射液的6个杂质进行检查，并对该方法进行方法学验证，结果准确、可靠，适用于检查醋酸阿托西班注射液中的有关物质。

本次研究使醋酸阿托西班注射液的质量研究更加充分，可为企业在进行产品研发过程中进行杂质研究提供参考思路，这对缩短产品的注册审评时间有很重要的意义。

参考文献:

[1]陈丽华.醋酸阿托西班治疗先兆早产的观察与护理[J].北方药学,2020,17(10):86-87.

[2]国家食品药品监督管理局药品审评中心.关于发布《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》等3个文件的通告(2020年第2号)[EB/OL].(2020-05-14)[2024-01-05].

[3]国家食品药品监督管理局药品审评中心.化学药物杂质研究技术指导原则[S].2005.

[4]姚志勇,支钦,李新宇.HPLC法测定醋酸阿托西班有关物质的研究[J].中国处方药,2014,12(5):8-11.

[5]李玉勤.醋酸阿托西班注射液研发和质量研究[D].南京:南京大学,2017.

[6]国家食品药品监督管理局药品审评中心.原研产品的进口药品注册标准(JX20110002)[S].2011.