Leber先天性黑蒙症(Leber congenital amauro‐sis,LCA)，是一种发病较早、最严重的遗传性视网膜疾病，由德国眼科医师Theodor Leber于1869年报道(王淑然,陈有信,2013)。LCA大多数属于常染色体隐形遗传疾病，通常导致婴幼儿出生后视锥、视杆细胞功能丧失，引发视网膜病变(周琦等,2018)。迄今为止，已发现28种LCA的致病基因，约占患病人数的75%，其余患者的致病基因尚不清楚，其中最常见的致病基因包括芳烃受体相互作用蛋白1 (aryl hydrocarbon receptor interacting protein like 1,AIPL1)、碎屑细胞极性复杂成分1 (crumbs homolog 1,CRB1)、鸟苷酸环化酶2D (guanylate cy‐clase 2D,GUCY2D)、视网膜色素上皮65 (retinal pig‐ment epithelium 65,RPE65)和视网膜色素变性GTP酶调控相互作用蛋白1 (retinitis pigmentosa GT‐Pase regulator interacting protein 1,RPGRIP1)(Cre‐mers et al.,2002)。临床上，LCA尚无特效治疗手段和药物，随着基因编辑技术的快速发展，针对RPE65、RPGRIP1、AIPL1和GUCY2D基因引发的LCA，已从基因治疗方向开展相关的研究，而治疗手段的开发和临床药物的筛选都需要合适的试验动物模型作为研究基础(魏天颖,祁鸣,2013)。

RPE65基因在RPE视循环中具有重要的视功能作用，通常在视网膜上皮中合成。作为LCA最常见的致病基因之一，RPE65基因突变会引发LCA等遗传性视网膜疾病，典型的临床症状包括夜盲症、视野缩小甚至视力丧失(Ripamonti et al.,2014)。研究发现，RPE65基因在视循环过程中可将全反式视黄酯转化成11-顺式视黄醇，并改变视紫红质构象，引发大脑的视神经脉冲，从而产生视觉(Red‐mond et al.,1998;Redmond et al.,2005)。通过对RPE65基因突变患者临床统计发现，发病患者的视力会随着年龄的增加逐渐降低，并伴有发育迟缓和视神经系统异常等症状，其中视网膜电图显示a、b波相对平坦与RPE65基因缺陷犬(Canis lupus familiaris)的表现尤为相似(Aguirre et al.,1998;Jacobson et al.,2009;Klein et al.,2014;Mowat et al.,2017)。

转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)基因编辑技术是近些年出现的较为热门的技术之一，具有构建方便、高效且安全等优点，主要由特异性的DNA识别域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶构成(Hock‐emeyer et al.,2011)。DNA识别域是由多个TALE蛋白连接而成，能够靶向与DNA特异位点相结合，然后在FokⅠ核酸内切酶的作用下，对DNA靶序列进行剪切，造成DNA的双链断裂(double-strand break,DSB)，诱导DNA产生非同源末端修复(nonhomologous end joining,NHEJ)或者同源重组(ho‐mologous recombination,HR)，达到对基因序列改造的目的(Tesson et al.,2011)。本研究利用TALEN基因编辑技术构建RPE65基因编辑犬，为RPE65基因突变的研究提供良好的试验动物模型；通过系统的眼科表型分析检测，为RPE65基因突变的研究提供科学的数据资料。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物材料

选用普通级别实验比格犬(Canis lupus familiaris)，体重10～15 kg，年龄2～3周岁，均购自青岛博隆实验动物有限公司(许可证号:SCXK鲁2017-0006)。试验犬在饲养期间自由饮水，生长维持饲料购自北京科澳协力饲料有限公司(京饲证2018-06073)，饲养于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司(许可证号:SYXK苏2019-0012)，动物房室温控制在18～26℃，相对湿度控制在40%～70%，光照12 h，明暗交替。本研究的动物使用方法经公共动物保健和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)批准，IACUC批准编号：ACU21-2147。

1.1.2实验试剂和仪器

PacⅠ、T7E1核酸内切酶试剂盒、RNA纯化试剂盒均购自北京纽英伦生物技术有限公司，大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态细胞购自安徽通用生物有限公司(滁州)，DNA提取、回收试剂盒、PCR相关试剂购自北京天根生化科技有限公司。

实时荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司，DNA电泳仪购自美国Bio-Rad公司，凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司，ADVIA Centaur CP全自动化学发光免疫分析仪购自德国Siemens公司，Ti-2U显微操作系统购自日本Nikon公司，CDS-9000动物麻醉机购自香港友诚生物科技有限公司，ZS-MX-HX动物呼吸机购自北京众实迪创科技发展有限责任公司，MF-900拉针仪购自日本Narishige公司，SZX1270体式显微镜购自日本Nikon公司。

1.2实验方法

本研究以比格犬为实验动物对象，利用TAL‐EN基因编辑技术，通过显微注射的方式对犬受精卵进行基因编辑并移植至实验犬输卵管内，在妊娠期60 d后获得RPE65基因编辑幼犬并进行眼科表型分析检测。

1.2.1 RPE65基因编辑载体的构建

犬RPE65基因(Gen Bank No.NM＿001003176.1;Ensembl编号:EN‐SCAFG00845013646)的第3号外显子(Exon3)和第7号外显子(Exon7)选为TALEN打靶位点，使用MEGAscript™T7 Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.,美国)进行m RNA体外转录合成，将产生的TALEN m RNAs注射到受精卵中。分别设计靶向Exon3序列：5'-TGGCTCACGGGCAGTCTCCTCc‐gatgcggaccgggg CTCTTCGAGGTTGGATCTGAA-3'；其中大写字母为TALE结合结构域辨识序列，小写字母为FokⅠ核酸内切酶剪切序列。TALEN识别上游序列TGGCTCACGGGCAGTCTCCTC对应的左臂DNA识别域的多个TALE蛋白：NH NH HD NG HD NI HD NH NH NH HD NI NH NG HD NG HD HD NG HD和下游序列TTCAGATC‐CAACCTCGAAGAG对应的右臂DNA识别域的多个TALE蛋白：NG HD NI NH NI NG HD HD NI NI HD HD NG HD NH NI NI NH NI NH。靶向Exon7序列：5'-TTCCCCTGCAGCGACC‐GATTcaagccatcgtacgt CCATAGGTAACTTGAA-3'，其中TALEN识别上游序列TTCCCCTGCAGC‐GACCGATT对应的左臂DNA识别域的多个TALE蛋白：NG HD HD HD HD NG NH HD NI NH HD NH NI HD HD NH NI NG NG和下游序列TTCAAGTTACCTATGG对应的右臂DNA识别域的多个TALE蛋白：NG HD NI NI NH NG NG NI HD HD NG NI NG NH NH。靶向Exon3序列和Exon7序列结合的左臂和右臂编码序列，经通用生物(安徽)股份有限公司采用全基因合成的方式构建构于pc DNA3.1(+)载体上，用PacⅠ切成线性DNA模板，运用MEGAscript™T7 Kit进行m RNA合成，将合成的m RNA纯化，分装存储于-80℃保存，用于受精卵胞质注射。

1.2.2受精卵注射创建RPE65基因编辑犬

采用25只发情雌性比格犬，同时作为受精卵的供体和受精卵移植的受体。待母犬发情后，每日采血检测血清中孕酮值增量情况，根据孕酮值首次>4的数值，并结合母犬的年龄判断排卵时间，确定配种和冲卵手术时间。实验母犬配种后第2天进行手术，麻醉打开腹腔并找到输卵管及子宫角，逆子宫角方向进针，确认针头进入输卵管后开始冲卵，收集冲卵液至10 m L离心管中。通过单侧输卵管手术冲卵的方式，25只发情母犬累计获得128枚受精卵，使用捡卵针在0.1%的透明质酸酶培养基中，脱去卵丘颗粒细胞备用。

将合成好的TALEN m RNA从-80℃冰箱取出置冰上溶解，低温高速离心5 min后装针，胞质注射时快速扎进胞质内，轻推微调注射器，迅速拔针，低倍镜确认基因仍然持续流动。将完成胞质注射的受精卵置于37℃水浴锅预热的15 m L离心管内送往手术室，移植至另一侧未进行手术冲卵的输卵管内。

1.2.3 RPE65基因编辑犬基因突变检测

幼犬出生后，采集犬脐带、犬尾组织进行分子鉴定。将采集的组织剪碎后，通过基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,北京)得到犬基因组DNA溶液。以犬基因组为模板，针对RPE65基因的Exon3和Exon7靶点分别设计2对正向和反向引物并进行PCR扩增，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成(表1)。PCR反应体系(20μL):1μL的基因组DNA、10μmol/L上下游引物各1μL、10μL的2×Taq酶、7μL dd H₂O。反应条件：94℃2 min;94℃20 s、65℃1 min、72℃1 min,10个循环；95℃30 s、60℃1 min、72℃1 min,30个循环；72℃5 min、25℃2 min。将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

电泳结束产生单一的PCR产物条带时，利用T7E1核酸内切酶试剂盒检测PCR扩增产物。T7E1酶切反应体系(22μL):8μL PCR amplicons、2μL的10×NEB2、12μL dd H2O；反应条件：95℃5 min、95～85℃(-2℃/s)、85～25℃(-0.1℃/s)、4℃2 min。退火完成后，加入19μL的Heterodu‐plex、1μL的T7E1缓冲液，37℃条件下孵育15min。来自野生型的PCR产物双链之间会完全匹配，核酸内切酶无法将产物切割，电泳结果只呈现1个条带；来自基因编辑犬的PCR产物退火形成不能完全相匹配的DNA序列，核酸内切酶能够将其识别并进行切割。

1.2.4 RPE65基因编辑犬的表型分析检测

分别将1只RPE65基因编辑犬和4只同龄野生型犬设为1组，野生型犬雌、雄随机，共2组，共10只。在1月龄幼犬睁眼后，进行各项眼科表型分析检测，检测前先给预试验动物0.5%复方吡卡胺滴眼液1至2滴进行散瞳，然后肌肉注射舒泰(用量:8 mg/kg,浓度:50 mg/m L)和盐酸塞拉嗪(用量:0.6 mg/kg,浓度:20 mg/m L)，对试验动物进行全身麻醉。通过临床观察、常规眼科检查、眼底照相(fundus photography,FP)、光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)、全视野视网膜电图(electroretinography,ERG)进行系统的表型分析检测。

2、结果与分析

2.1 RPE65基因编辑犬基因突变检测

将犬脐带、犬尾组织剪碎后，用基因组DNA提取试剂盒提取犬基因组DNA溶液，以其模板进行PCR扩增。根据T7E1酶切和Sanger测序结果发现，出生的63只幼犬中有2只公幼犬(R4和R21)，在RPE65基因的Exon3和Exon7靶位点产生基因编辑。RPE65基因编辑犬(R4)在Exon3靶位点存在2种突变类型，均为删除10个碱基对；Exon7靶位点也存在2种突变类型，一种为插入13个碱基对、另一种为插入11个碱基对(图1;图2)。另一只RPE65基因编辑犬(R21)在Exon3靶位点的突变类型为删除10个碱基对；Exon7靶位点的突变类型为删除4个碱基(图3;图4)。基因鉴定结果表明，本研究成功获得2只RPE65基因编辑犬，可进行后续的表型分析检测。

2.2常规眼科检查

待基因编辑幼犬满月睁眼时，进行常规眼科检查。使用裂隙灯观察幼犬的眼前节(眼睑,结膜,巩膜,角膜,虹膜,瞳孔,晶状体和前部玻璃体等)，使用直接检眼镜观察幼犬的眼底。检查期间，幼犬偶见因群养笼内斗殴或眼科检查操作引起的结膜分泌物、结膜充血、结膜水肿和肿胀等异常表现，随后均自然恢复，未见因动物基因缺陷引起的眼前节异常。

2.3眼底照相

分别在RPE65基因编辑幼犬和野生型幼犬1、2、3月龄时使用数字眼底造影检查仪对双眼进行FP检测。野生型试验犬眼底动静脉管径比值通常是2∶3，静脉血含氧量低、颜色偏暗，动脉血含氧量高、颜色偏亮。与3月龄野生型幼犬相比，RPE65基因编辑幼犬眼底可见动静脉变细，视神经萎缩，暂时未观察到脉络膜、视网膜色素变性(图5)。

表1 扩增RPE65基因靶点所用引物

2.4光学相干断层扫描

使用Spectralis HRT+OCTT诊断仪对RPE65基因编辑幼犬和野生型幼犬双眼进行OCT检测。结果如图6所示，3月龄RPE65基因编辑幼犬视盘颞侧约400μm处视网膜及各层厚度暂时未见明显改变。如图7所示，3月龄RPE65基因编辑幼犬视网膜椭圆体带(ellipsoid zone,EZ层)呈现的弥漫性反射偏弱；由于椭圆体带作为视网膜光感受器所在重要区域，是评估光感受器损伤的最佳部位，可判定RPE65基因编辑幼犬光感受器细胞受到损伤。

2.5眼底光学相干断层血管扫描

脉络膜是一种在视网膜和巩膜中间的血管组织结构，不仅为视网膜外层提供充足的氧气和营养物质，还能够参与调控眼部的温度、视觉信号、分泌相关生长因子，在正常的视功能循环过程中起重要作用。如图8所示，与3月龄野生型幼犬相比，3月龄RPE65基因编辑幼犬在视神经周围的视网膜血流和脉络膜血流密度明显降低，存在一定程度的视功能循环障碍。

图1 RPE65基因编辑犬(R4)第3号外显子靶位点的鉴定

图2 RPE65基因编辑犬(R4)第7号外显子靶位点的鉴定

2.6全视野视网膜电图

ERG可通过短暂的闪光刺激诱导视网膜产生综合电位反应，是一种评估活体视网膜功能的科学手段，本研究在RPE65基因编辑幼犬和野生型幼犬3月龄时，对其双眼进行暗适应3.0 ERG+Ops和明适应3.0 ERG检测。其中a波为负相波，主要受光感受器细胞功能的影响，潜伏期较短的a波称ap，受视锥细胞电活动的影响；潜伏期较长的a波称as，受视杆细胞电活动的影响；b波为正相波，形成于a波之后，主要受视网膜双极细胞层的Muller细胞功能的影响。振荡电位(oscillatory potentials,ops)是叠加在ERG的b波上一组小波形，属于高频成份，主要受视网膜内层无长突细胞功能的影响。如图9所示，与野生型犬相比，3月龄RPE65基因编辑犬可见暗适应和明适应ERG a、b波振幅降低，峰时明显延长，表明视网膜光感受器细胞功能受损。

图3 RPE65基因编辑犬(R21)第3号外显子靶位点的鉴定

图4 RPE65基因编辑犬(R21)第7号外显子靶位点的鉴定

3、讨论

人类RPE65基因在视网膜色素上皮细胞中特异性表达，含14个外显子，编码533个氨基酸及65k D蛋白质，在视循环功能中起着关键作用(Morimura et al.,1998;Thompson et al.,2000)。临床上，RPE65基因突变可引发视网膜色素变性(reti‐nitis pigmentosa,RP)和LCA，属于常染色体隐形遗传，通常导致婴幼儿在出生后视锥、视杆细胞功能丧失，引发视网膜病变；随着年龄的增加，还可能出现白内障、眼球内陷等并发症状；严重患者晚期可出现永久性失明。本研究通过本次构建动物疾病模型的研究再一次证实了RPE65基因突变会引发视网膜功能损伤，视力减退等临床症状；这与An‐near等(2021)报道的自然突变RPE65基因缺陷犬视功能损伤症状高度相似。当前RPE65基因突变的治疗研究多数局限在基因水平，缺乏更全面、更系统的治疗手段和特效药物，主要原因之一就是缺少能够科学模拟临床症状的实验动物疾病模型(Narfstromet al.,2003;Mowat et al.,2013;Miraldi et al.,2018)。

图5 RPE65基因编辑幼犬和野生型幼犬眼底彩照(FP)检测

图6 RPE65基因编辑幼犬和野生型幼犬光学相干断层扫描视网膜各层厚度检测

关于人工构建RPE65基因编辑动物疾病模型，虽然有RPE65基因编辑小鼠(Mus musculus)的相关报道，但是鼠属于夜行动物，除了视网膜整体大小与人类有明显差异以外，视椎细胞功能也有所欠缺，表型与人类相比差异较大，不可作为视网膜疾病模式动物的首选(Tanabu et al.,2019)。而比格犬作为生物医学相关研究中最常见的实验动物之一，在基因组方面与人类高度相似，已成为国际医学界公认的理想实验犬种。此外，与其他常见的实验动物相比，犬类动物具有特异性的物种生殖特征，例如单发情、多胎和非季节性生殖周期等等，导致犬类动物疾病模型的开发远远落后于其他实验动物，并成为本次研究的技术难点和创新点。

图7 RPE65基因编辑幼犬和野生型幼犬光学相干断层扫描视网膜椭圆体带(EZ)层检测

眼底OCT视网膜扫描成像与视网膜横断面成像；箭头：3月龄犬视网膜椭圆体带(EZ层)

图8 RPE65基因编辑幼犬与野生型幼犬视网膜周围血流密度检测

本研究通过TALEN基因编辑技术结合显微操作，获得的RPE65基因编辑犬可呈现LCA的原发症状，临床表型持续时间长、稳定性强并具有可遗传性，可作为良好的动物疾病模型。此外，本研究虽然移植了63枚受精卵，但是只获得了2只基因编辑幼犬。主要原因可能是本研究采用的TALEN基因编辑技术是通过一段序列识别靶基因，容易出现错配导致切割，造成脱靶效应；其次，采用受精卵自体移植的方式，通过收集单侧输卵管受精卵进行基因编辑并移植至另一侧输卵管内，而受移植侧输卵管内的受精卵并没有进行基因编辑操作，造成部分出生的幼犬属于野生型。在以后的研究中，提高基因编辑效率将成为一项重要工作。综上所述，通过基因编辑技术构建数量充足且性状表达稳定的动物疾病模型，将成为未来研究基因缺陷遗传病的一大热点。

4、结论

本研究利用TALEN基因编辑技术成功获得2只RPE65基因编辑雄幼犬；并通过眼科表型分析检测发现，RPE65基因编辑幼犬眼底动静脉血管稀疏变细、色素变浅；视神经周围视网膜血流和脉络膜血流密度明显降低；视网膜电图显示a波和b波振幅明显降低、峰时明显延长；提示视网膜功能受损，可作为良好的动物疾病模型。

图9 RPE65基因编辑幼犬与野生型幼犬暗适应和明适应ERG检测

参考文献:

王淑然,陈有信.2013.Leber先天性黑矇致病基因及相关临床表型研究进展[J].中华实验眼科杂志,31(12):1178-1182.

魏天颖,祁鸣.Leber先天性黑蒙症分子机制研究新进展及未来展望[J].科学通报,58(36):3770-3776.

周琦,李自圆,陆方.2018.Leber先天性黑矇患者的临床表型及遗传学分析[J].华西医学,33(11):1359-1366.

基金资助:国家自然科学基金(32060812); 甘肃省高校产业支撑项目(2020C-14); 甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室经费资助(20JR10RA563);

文章来源:徐铮,李振诚,赖威仲,等.利用TALEN技术创建RPE65基因编辑犬[J].农业生物技术学报,2024,32(06):1452-1461.