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基于网络药理学对妇科再造丸治疗气血虚证的机理研究

2024-11-29 96 上传者：管理员

摘要：目的运用网络药理学与分子对接探究妇科再造丸治疗气血虚证的作用机制。方法通过TCMSP等数据库筛选妇科再造丸活性成分，运用SwissTargetPrediction确定成分基因靶点。运用OMIM等数据库查找疾病靶点。取成分与疾病的交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络，筛选核心靶点。将交集靶点导入DAVID数据库进行GO功能及KEGG通路分析。最后对主要活性成分和核心靶点进行分子对接。结果得到514个妇科再造丸活性成分及1 489个成分靶点基因；筛选到气血虚证疾病靶点6 337个，交集靶点843个。经PPI网络分析得到8个核心靶点。GO分析主要涉及生物过程1 644条、细胞组分214条、分子功能397条；KEGG通路富集得到214条。分子对接结果表明主要活性成分与核心靶点的对接构象合理。结论妇科再造丸可通过癌症通路、钙信号通路、MAPK信号通路等通路治疗气血虚证。

关键词：
SQBD
分子对接
妇科再造丸
气血虚证
网络药理学
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气血虚证(syndrome of both qi and blood deficiency, SQBD)为一中医证候名，近年来，现代人由于生活不规律，精神压力大等多种原因，极易患上气血虚证，多出现面色苍白、皮肤暗黄、手凉脚凉、入睡困难等临床表现 ,严重影响患者生活质量和身体健康，且该病证有年轻化的趋势。就中医理论而言，气血是生命的基本物质[1],血液在人体有营养滋润的作用，而气能行血，两者相互依存、相互滋生，将脾胃化生之水谷精微运行于脉中，送至五脏六腑，保证人体脏器的正常生理功能，维持人体正常生命活动的进行，气血与脏腑密不可分[2]。

妇科再造丸(FKW)是贵州省王聘贤老中医的经验方，由当归、香附、黄芩、三七等42味中药组成，具有养血调经、暖宫止痛等功效。临床上广泛用于治疗月经不调、痛经、妇科炎症等妇科慢性疾病。课题组前期研究发现KFW还可用于治疗气血虚证，但其机制尚不明确。因此，本文以“中药-成分-靶点”为切入点，运用网络药理学和分子对接的方法进行整体分析，探讨FKW治疗SQBD的可能机制，为SQBD的临床治疗提供新的理论支持。

1、方法

1.1 FKW活性成分及潜在靶点的筛选

在TCMSP数据库中以口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18为条件检索FKW中各味药活性成分；再使用Swiss ADME对周雪等[3]检测与鉴定到的FKW成分进行筛选，筛选原则为胃肠道吸收为high, 类药五原则(Lipinski, Ghose, Veber, Egan和Muegge)中至少有两个结果为“Yes”,将符合的成分定为FKW活性成分补充。通过SwissTargetPredictio数据库查询靶点基因，删去重复基因得到FKW成分靶点。

1.2 SQBD疾病靶点筛选

以“Anemia”“Fatigue”“Less menstruation”为关键词，收集DrugBank 、Gene Cards和OMIM数据库中相关靶点，Gene Cards数据库筛选条件为Relevance score大于中位数。将三个数据库获得的靶点汇总，删去重复数据，得到疾病靶点。

1.3 成分-疾病交集靶点获取

利用Venny 2.1.0网站绘制韦恩图获取药物与疾病的交集靶点。

1.4 “成分-靶点”网络图构建

利用Cytoscape软件建立“成分-交集靶点”网络图，选定自由度(Degree)值最大的前五个为主要活性成分。

1.5 PPI网络构建与核心靶点分析

将交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络，置信度设为0.9,并隐藏散在节点。应用Cytoscape 软件进行可视化分析，以Degree、Closeness和Betweenness为量化指标，筛选核心靶点。

1.6 靶点GO分析与KEGG通路富集分析

将交集靶点导入DAVID数据库，选定物种信息为Homo sapiens, 进行GO功能和KEGG通路富集分析。再根据P值排序选取靠前的结果并在微生信平台对结果进行可视化。

1.7 构建“药物-成分-靶点-疾病-通路”图

使用Cytoscape软件构建“FKW-成分-交集靶点-SQBD-通路”网络关系图，图中的各节点分别代表FKW、成分、交集靶点、主要信号通路及SQBD,边则代表他们之间的相互作用。

1.8 分子对接

将主要活性成分作为配体，核心靶点作为受体，进行分子对接。当结合能小于0说明配体与受体可以自发结合，配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大，这里以结合能≤-5.0 kJ/mol作为筛选标准[4]。

2、结果

2.1 FKW活性成分及作用靶点获取

在TCMSP数据库中检索到FKW各味药活性成分共470种，周雪等[3]检测与鉴定到的FKW成分经筛选后得到活性成分58种，去除重复项得到活性成分共514种。通过SwissTargetPrediction数据库查询到靶点基因1 489个。

2.2 SQBD靶点与交集获取

通过OMIM 、DrugBank和GeneCards 数据库获得SQBD疾病靶点6 337个，绘制韦恩图得到交集靶点843个。见图1。

图1成分与疾病靶点韦恩图

2.3 “成分-靶点”网络图构建

将有效成分与交集靶点信息导入Cytoscape构建“成分-靶点”网络图，其中红色V形代表药物，绿色六边形代表成分，蓝色矩形代表靶点，选取Degree值排名前五个为主要活性成分，分别为Nobiletin(川陈皮素)、Norwogonin(去甲汉黄芩素)、Wogonin(汉黄芩素)、Ellagic acid(鞣花酸)和Quercetin(槲皮素)。见图2。

图2 “成分-靶点”网络图

2.4 PPI网络构建

将交集靶点导入到STRING数据库构建PPI网络，得到841个节点和3 255条连接线，其中节点代表蛋白，边代表蛋白之间的联系。运用Cytoscape软件进行可视化，节点直径越大、颜色越深，说明节点 Degree值越高，与之相互作用的蛋白越多；边越粗、颜色越深说明两蛋白之间的相互作用越强。见图3。通过计算Degree、Closeness、Betweenness值分别筛选出值最大的前20个靶点，并取交集，得到8个交集靶点，以此为核心靶点。核心靶点关系图见图4。

图3 成分-疾病交集靶点PPI网络图

图4核心靶点关系图

2.5 靶点通路分析

通过DAVID数据库对成分与疾病的交集靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析，其中GO分析包括了细胞组分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)分析。

2.5.1 GO功能分析

GO功能富集到的条目共2 255个，其中有BP 1 644条、CC 214条、MF 397条，选择P值相对较小且靶点富集多的前10个进行可视化作图。结果见图5。

图5成分-疾病交集靶点GO功能富集图

2.5.2 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析后共得到通路214条，选择P值相对较小且靶点富集多的前20条通路进行可视化。图中点的颜色越深，可信度越高，点越大则包含的基因数越多。见图6。

2.6“FKW-成分-靶点-SQBD-通路”网络图构建

构建“FKW活性成分交集靶点SQBD通路”图。见图7。其中红色V形代表FKW,绿色圆形代表活性成分，红色三角形代表SQBD,蓝色六边形代表通路，橙色矩形代表交集靶点，边代表几者之间的相互作用。节点越大越重要，其治疗作用越大。

图6成分-疾病交集靶点KEGG通路富集图

图7 “FKW-活性成分-交集靶点-SQBD-通路”图

2.7 分子对接

为检验关键成分和核心靶点结合构象的稳定性，应用分子对接技术探讨FKW治疗SQBD的作用机制，选取核心靶点和主要活性成分进行分子对接。以结合能≤-5 kJ/mol作为筛选标准，结果表明主要活性成分和核心靶点有较好的结合活性。对接结果见表1。将部分结果进行可视化，见图8。

表1妇科再造丸主要活性成分与核心靶点结合能

图8分子对接可视化

3、讨论

妇科再造丸是一种多成分、多靶点、多机制的复方中药，本研究通过网络药理学方法筛选得到妇科再造丸有效活性成分514种。根据“成分-靶点”网络图的构建，发现主要活性成分为川陈皮素、去甲汉黄芩素、汉黄芩素、鞣花酸和槲皮素。这些成分与疾病靶点关系密切，主要存在于黄芩、牛膝、香附、三七、黄芪、益母草、甘草等药物中，与其他活性成分一起作用于网络中多个靶点，从而达到治疗SQBD的目的。有研究[5-6]表明，槲皮素可能通过改善铁代谢和防止肾衰性贫血导致的促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)降低来发挥治疗SQBD的作用，这可能与槲皮素能经过调控气血虚小鼠中PTGS-2 mRNA的表达以降低TNF-α的释放，抑制TNF信号途径的激活过程有关[7]。鞣花酸具有凝血功能及抗癌等作用[8],而有研究[9]表明，血虚小鼠的血瘀出血可能与其凝血功能异常有关，进一步推测凝血功能是鞣花酸有效治疗SQBD的机制之一。

通过PPI分析得知，TP53、SRC、HSP90AA1、PRKACA、STAT3、PRKACB、ESR1、CTNNB1是FKW活性成分治疗SQBD的核心靶点。TP53自被发现以来，一直是基因分子的研究热点[10],是重要的抗癌基因，在调控细胞周期、DNA损失、清除自由基等过程中均起到重要作用。STAT3是信号转导和转录激活因子(STAT)家族成员，其中STAT3突变在造血系统肿瘤中起着关键作用，是STAT3家族在造血系统恶性肿瘤中最常见的突变基因，其在EPO信号转导中发挥作用，能影响并调节血管生成[11-13]。

KEGG通路富集分析发现，FKW治疗SQBD的主要通路有：癌症通路、钙信号通路、MAPK信号通路等。恶性肿瘤的部分症状可辨证为SQBD[14],可见通过调节癌症通路可以改善SQBD。以往研究[15]表明，钙信号通路在免疫系统的各种细胞功能调节中起着关键作用。细胞内Ca2+上调可促进T细胞和B细胞的增殖和活化，进而能够提高机体的免疫功能[16]。MAPK通路与Th1/Th2平衡有着密切的联系，而机体内Th1/Th2相对平衡能够维持免疫功能的平衡稳定[17]。免疫力提高能够有效改善气血虚证，由此可见，可通过调节钙信号通路、MAPK通路来改善气血两虚证。

基于以上网络药理学研究结果，我们对5种主要活性成分和8个核心靶点进行分子对接。绝大部分都有较好的结合活性，说明组合稳定。本研究说明FKW治疗SQBD具有多成分、多靶点、多途径的特点，为进一步研究FKW治疗SQBD的作用机制提供了理论依据和研究思路。

参考文献:

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基金资助:贵州中医药大学大学生创新训练计划项目(贵中医大创合字[2023]129号);贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK[2022]一般461);全国中医药创新骨干人才培训项目(国中医药人教函[2019]128号);贵州省高层次创新型人才项目(黔人领发[2020]4号);国家中医药管理局省级中药炮制技术传承基地建设项目(国中医科技[2015]132号);贵州中药､民族药材产地加工与饮片炮制工程研究中心项目(黔发改[2015]542号);

文章来源:黄云,蒋嘉馨,林明金,等.基于网络药理学对妇科再造丸治疗气血虚证的机理研究[J].贵州中医药大学学报,2024,46(06):67-73.