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甲磺酸乐伐替尼对猪胸导管内皮细胞增殖和侵袭的影响

2024-08-13 11 上传者：管理员

摘要：目的研究甲磺酸乐伐替尼（Levatinib mesylate）对取自猪胸导管的淋巴管内皮细胞（LECs）增殖和侵袭的影响，探讨甲磺酸乐伐替尼对淋巴管生成作用的相关调控机制。方法取健康猪的胸导管消化法进行LECs原代培养，用VEGFR-3（血管内皮生长因子-3）进行鉴定；采用EdU检测法检测甲磺酸乐伐替尼药物作用后LECs的增殖活力；采用Transwell侵袭实验检测甲磺酸乐伐替尼是否对LECs的侵袭能力有影响；Western blot（蛋白质印迹）法分别测定甲磺酸乐伐替尼药物作用后LECs的VEGFR-3靶蛋白的含量。结果 EdU结果显示，甲磺酸乐伐替尼药物作用后LECs增殖能力降低，当药物浓度达到10 nmol/L时，实验组EdU标记率（25±6）%明显低于对照组（49±9）%,LECs的增殖能力被甲磺酸乐伐替尼显著抑制（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果可见，LECs的侵袭能力能够被甲磺酸乐伐替尼抑制，当药物浓度达到10 nmol/L时，实验组LECs侵袭数量（66.33±8.93）低于对照组（138.67±7.02）,LECs透膜数量明显减少（P<0.05）;Western blot结果可见，甲磺酸乐伐替尼可以下调LECs的VEGFR-3蛋白表达，且随着药物浓度的增加，蛋白含量下调更为显著（P<0.05）。结论甲磺酸乐伐替尼可通过作用于VEGFR-3靶蛋白，从而抑制LECs增殖和侵袭。

关键词：
VEGF
淋巴管内皮细胞
甲磺酸乐伐替尼
血管内皮生成因子
血管内皮生成因子受体
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根据文献显示，2020年统计，全世界患癌症的病例达1 930万，其中近1 000万人死亡，严重影响人们的生活和生存质量[1]。肿瘤早期可向淋巴结转移，肿瘤细胞增殖分化后经淋巴管向远处转移是肿瘤扩散的一种常见方式[2]。研究发现淋巴管内皮细胞的增殖和迁移是一个复杂的过程，有多重因素影响其生物学行为[3]。随着近年来的研究进展，发现肿瘤内的淋巴管生成过程中有血管内皮生长因子参与，抑制肿瘤新生淋巴管中的关键作用点位是通过激活血管内皮生成因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）和相应的血管内皮生成因子受体（VEGFR）信号传导通路来促进新生肿瘤细胞分化及其淋巴管生成。因此，探讨可抑制肿瘤淋巴管生成的靶向治疗药物，通过抑制淋巴管生成来阻断恶性肿瘤远处扩散，减少肿瘤死亡的概率并能够提高肿瘤的预防和治疗。

甲磺酸乐伐替尼是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，它可能对多种癌症起作用[4-5]。在一项欧美国家研究的用甲磺酸乐伐替尼治疗肿瘤实验中发现在肾细胞癌、子宫内膜癌和结肠癌等的瘤体体积有不断减小的情况，甲磺酸乐伐替尼抑制成纤维细胞生长因子受体、干细胞因子受体、转染和VEGFR1‐3重新排列。这些受体的作用是促使肿瘤淋巴管生成，所以，可通过抑制这些受体的功能来抑制肿瘤淋巴管生成[6]。本实验研究甲磺酸乐伐替尼对取自猪胸导管的淋巴管内皮细胞（Lym‐phatic endothelial cells,LECs）增殖和侵袭的影响，检测淋巴管内皮细胞VEGFR‐3靶蛋白的含量，探讨可能存在的调控机制。

1、材料和方法

1.1 主要材料

取健康猪（雌雄不限，体重120 kg，猪龄6个月）的胸导管，原代取材LECs；内皮细胞培养基（ECM）（中乔新舟生物），基质胶Mateigel、胶原酶、FBS（胎牛血清）、胰蛋白酶和甲磺酸乐伐替尼（北京索莱宝），EdU试剂（北京信生元），一抗（VEGFR‐3 rabbit polyclonal antibody）、一抗（GAPDH mouse polyclonal antibody）和二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG）（上海碧云天），等。

1.2 方法

1.2.1 LECs培养和鉴定

于猪的胸导管两端插入塑料导管，向胸导管内注射适量的胶原酶，37℃消化15 min，冲洗收集消化液，1000 rpm离心10 min，将混匀取材的LECs接种于培养瓶中培养，对数生长期时进行传代、鉴定和后续增殖、侵袭及蛋白质免疫印迹实验。

1.2.2 EdU细胞增殖实验

取生长良好的细胞，以1×105的细胞密度铺在培养板中，设置对照组（只含有LECs和培养液）和浓度5 nmol/L、10 nmol/L的甲磺酸乐伐替尼药物组，每组处理3个复孔，处理48 h后加入100μL 50μmol/L EdU培养基，孵育2h；加入150μL固定液，室温孵育0.5 h；加入甘氨酸50μL 2 mg/mL，在脱色摇床上孵育5 min；加入100μL渗透剂，脱色摇床上孵育10 min；加入100μL 1×Apollo®染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育0.5 h；加入100μL渗透剂脱色摇床中，洗涤3次，每次10 min；加入100μL Hoechst 33342反应液，脱色、避光、常温下摇床孵育0.5 h，洗涤2次，镜下观察和分析结果。

1.2.3 细胞侵袭实验

取生长良好的细胞，以1×105的细胞密度接种于预铺Matrigel（基底胶）的transwell小室中，设置对照组（只含有LECs和培养液）和浓度为5 nmol/L、10 nmol/L的甲磺酸乐伐替尼药物组，每组处理3个复孔，按照上述分组，在下室内加入600μL的培养基（含FBS），上室加入300μL细胞悬液，放置于培养箱，培养24 h；取出小室，吸掉上室内的液体，用一次性无菌棉签反复仔细擦净，37℃预温的PBS液漂洗2次，用提前冰预冷的4%多聚甲醛进行固定30 min，之后用结晶紫染色5 min；拍照观察并分析透过的细胞数量。

1.2.4 蛋白质免疫印迹实验

取生长良好的细胞，以1×105/孔的细胞密度铺在培养板中，24 h后，观察细胞生长情况，贴壁良好，无污染。设置对照组（只含有LECs和培养液）和浓度为5 nmol/L、10nmol/L的甲磺酸乐伐替尼药物组，每组处理3个复孔，按照上述分组加入药物，24 h后收集细胞用于WB检测。弃培养基，PBS漂洗细胞2次后，加100μL裂解液放在冰上裂解0.5 h，将裂解液4℃、12 000 rpm离心5 min，取上清，分装于0.5 mL离心管中置于-20℃保存。检测蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。加入相应量5×上样缓冲液，沸水中煮5 min使蛋白变性，电泳2 h，电压设置为40V，溴酚蓝刚跑出终止电泳，进行转膜。将膜用含5%脱脂牛奶的TBST室温下脱色摇床上封闭1 h。加入一抗VEGFR‐3(1∶1 000）和GAPDH(1∶5 000),4℃孵育过夜，TBST洗3次，加入辣根过氧化物标记的二抗（1∶5 000），室温孵育1 h,TBST洗3次，孵育ECL发光液，使用Bio‐Rad Image Lab凝胶成像系统曝光、成像。用Bio‐Rad Image Lab 4.0.1软件对蛋白表达灰度值分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0、GraphPad Prism8.0统计学软件对数据进行统计分析。数据以均值±标准差（Mean±SD）表示，两独立样本之间的比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 细胞培养和鉴定

原代取材的内皮细胞多成群或成簇的生长，中心部的细胞形态多呈梭形，而外周部细胞形态多呈多角形，突起较多（图1）。应用VEGFR‐3免疫组织化学法，镜下可见细胞胞浆很丰富，细胞中间偏黄、周边偏绿色、总体呈黄绿色荧光，表现为阳性反应的细胞，证明该细胞为LECs（图2）。

2.2 甲磺酸乐伐替尼对LECs增殖的影响

EdU实验结果可见，与对照组相比，甲磺酸乐伐替尼药物组中细胞增殖能力降低，当甲磺酸乐伐替尼药物组药物浓度达到10 nmol/L时，能显著影响LECs的增殖能力（P<0.05，表1，图3）。

2.3 甲磺酸乐伐替尼对LECs侵袭的影响

图1 淋巴管内皮细胞（×200)

图2 VEGFR⁃3鉴定的淋巴管内皮细胞（×200)

实验结果可见，与对照组相比，甲磺酸乐伐替尼药物组中影响LECs的侵袭能力，当药物浓度达到10 nmol/L时会对淋巴管内皮细胞的侵袭能力具有显著性影响（P<0.05，表1，图4）。

表1 甲磺酸乐伐替尼对LECs增殖和侵袭的影响的比较（Mean±SD)

2.4 甲磺酸乐伐替尼对LECs VEGFR⁃3表达的影响

实验结果可见，与对照组相比，甲磺酸乐伐替尼药物组中LECs的VEGFR‐3蛋白表达量下调，且随着药物浓度的增加，蛋白含量下调更为显著（图5）。

3、讨论

淋巴管生成的研究是随着血管生成研究而逐渐发展起来的。1971年，Folkman[7]在《肿瘤血管生成：治疗意义》一文中提出：实体瘤的生长总是伴随着新生血管的形成，可以通过抑制血管生成来治疗肿瘤的想法被提出并做了相关研究，为临伴随着新生血管的形成，可以通过抑制血管生成来治疗肿瘤的想法被提出并做了相关研究，为临床诊断和治疗提供新的思路。肿瘤的血管生成对维持肿瘤细胞的生存活性、营养成分的运输起着不可或缺的作用[8]。通过对肿瘤内血管生成不断研究，已经在抑制血管生成治疗肿瘤方面获得突出成绩[9-10]。随着分子生物学技术的进一步发展，VEGF‐C、VEGF‐D等促淋巴管生成调节因子成为研究热点，而随着Podoplanin、LYVE‐1、Prox1和VEGFR‐3等LECs特异性标志物的逐渐被发现，可以有效区分肿瘤淋巴管和血管了，使人们研究关注转向肿瘤细胞通过淋巴道向远处扩散中的新生淋巴管。研究证实肿瘤远处扩散与淋巴管生成有着密切的关联[11-12]。

图3 甲磺酸乐伐替尼对LECs增殖的影响（×200)

图4 甲磺酸乐伐替尼对LECs侵袭的影响（×200) A.对照组；B.5 nmol/L组；C.10 nmol/L组

图5 甲磺酸乐伐替尼对LECs上VEGFR⁃3蛋白表达量的影响n=3，与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01

甲磺酸乐伐替尼是一种小分子V型TKI，对VEGFR和FGFR家族具有更强的活性[13]。临床实验研究证实了甲磺酸乐伐替尼的肿瘤治疗效果，乐伐替尼是10多年来第一个获批用于一线治疗晚期HCC的新药[14]。甲磺酸乐伐替尼在多种癌症治疗效果中表现得尤为突出[15-16]。本研究为了探讨甲磺酸乐伐替尼对LECs的增殖和侵袭的影响，采用了EdU法和Transwell侵袭实验分别检测甲磺酸乐伐替尼药物作用后LECs的增殖活性和侵袭能力的变化，结果可见，甲磺酸乐伐替尼对LECs的增殖和侵袭的影响比较显著，EdU实验显示，随着甲磺酸乐伐替尼药物浓度增加，EdU标记的LECs明显减少（P<0.05);Transwell侵袭实验结果也显示，随着甲磺酸乐伐替尼药物浓度增加，LECs透膜数量均明显少于对照组（P<0.05）。证实了甲磺酸乐伐替尼对LECs增殖和侵袭具有抑制效应。

VEGFR‐3(FLT4）是VEGF‐C、D的受体，主要在LECs中表达，对淋巴管生成起关键作用[17-18]，能够促进淋巴管的形成，高度表达于继发性、原发性肿瘤以及Kaposi肉瘤中[19]。本研究为探讨甲磺酸乐伐替尼是否通过作用VEGFR‐3靶蛋白，从而抑制LECs增殖和侵袭，采用Western blot法检测甲磺酸乐伐替尼药物作用后的LECs VEGFR‐3含量变化，结果显示随着实验组的药物浓度不断增加，其VEGFR‐3的含量显著减少。由此推测，甲磺酸乐伐替尼可能通过VEGFR‐3来调控LECs增殖和侵袭。

综上所述，甲磺酸乐伐替尼可能通过作用于VEGFR‐3靶蛋白，从而抑制LECs增殖和侵袭。本研究结果为肿瘤诊治提供了分子靶点的实验数据参考。然而，肿瘤治疗中相应的作用靶点众多，在后续的研究中，将进一步分析甲磺酸乐伐替尼调控肿瘤细胞生物学行为的其他机制，为肿瘤的发生发展机制研究提供参考。

参考文献:

[2]王健,周原,张师前.宫颈癌淋巴管生成相关因子的研究进展[J].中国癌症防治杂志,2018,10(4):267-270.

[3]王晖,王芳涛,范跃祖.抗淋巴管生成治疗结直肠癌研究进展[J].外科研究与新技术,2021,10(1):64-67.

[8]宋恩霖,汪华侨.肿瘤侵袭转移新机制[J].解剖学研究,2010,32(5):380-382+388.

[16]马玉宝,朱海林.乐伐替尼抑制VEGF/MAPK/NF-κB治疗结肠癌及对患者T淋巴细胞亚群的影响[J].解剖学研究,2020,42(2):166-169.

基金资助:黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(2017-KYYWFMY-0677),牡丹江医学院研究生导师科研专项计划(YJS2X2022009);

文章来源:赵红博,熊桂宏,邸子轩,等.甲磺酸乐伐替尼对猪胸导管内皮细胞增殖和侵袭的影响[J].解剖学研究,2024,46(04):337-342.