摘要:目的:探讨瑞帕利辛(Reparixin)对棕榈酸(PA)诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的影响。方法:CCK-8(cell counting Kit-8)法检测不同浓度的PA或Reparixin处理后C2C12成肌细胞活力;将C2C12成肌细胞分为牛血清白蛋白组(BSA组)、PA组、PA+Reparixin组,免疫印迹检测SOCS3蛋白水平及胰岛素信号分子蛋白激酶B(Akt)和160 kD的蛋白激酶B底物(AS160)磷酸化水平,q PCR检测SOCS3 mRNA水平。将C2C12-GLUT4myc小鼠成肌细胞同上分组,ELISA检测细胞GLUT4myc转位。结果:0、100、200、300μmol/L的PA和0、20、30、40μmol/L的Reparixin均不影响C2C12细胞活力。PA降低胰岛素磷酸化Akt和AS160的作用(均P<0.000 1),Reparixin逆转PA的影响(F=86.78、264.6,P<0.001,P<0.000 1)。PA降低胰岛素促进GLUT4myc转位的作用(P<0.001),Reparixin逆转PA的影响(F=41.4,P<0.01)。PA上调SOCS3 mRNA(P<0.001)和蛋白水平(P<0.05),Reparixin逆转PA对SOCS3的影响(F=51.64、7.97,P<0.001,P<0.05)。结论:Reparixin可能通过下调SOCS3基因和蛋白表达,缓解棕榈酸诱导的小鼠C2C12成肌细胞胰岛素抵抗。
2型糖尿病是以高血糖为主要特点的代谢性病变,其重要特征是胰岛素抵抗[1],表现为胰岛素在其靶组织的作用减弱。骨骼肌是胰岛素最大的靶组织,餐后升高的葡萄糖80%左右由胰岛素刺激骨骼肌摄取[2]。胰岛素与骨骼肌细胞膜上的胰岛素受体结合,磷酸化胰岛素受体底物(IRS)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和160 kD的蛋白激酶B底物(AS160),进而促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)从胞质转位到细胞膜上,转运葡萄糖进入细胞,达到降低血糖的作用[3]。
细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)是细胞因子信号转导抑制蛋白家族成员,负责调节细胞因子信号转导,SOCS3干扰胰岛素信号分子的正常功能,使胰岛素信号转导减弱,导致胰岛素抵抗[4]。研究报道,肝脏中过度表达SOCS3导致胰岛素抵抗,抑制糖尿病小鼠SOCS3的表达可改善胰岛素抵抗[5]。
Reparixin是白细胞介素8受体(CXCR1/2)的抑制剂[6]。本研究旨在探讨Reparixin对棕榈酸诱导的C2C12小鼠成肌细胞胰岛素抵抗状态的影响及其潜在的分子机制。通过分析Reparixin如何影响胰岛素信号通路,尤其是在调节SOCS3表达方面,为开发新的糖尿病治疗策略提供科学依据。本研究不仅有助于深化对胰岛素抵抗和2型糖尿病发病机制的理解,而且为探索新的治疗靶点提供了重要信息。
1、材料与方法
1.1 实验材料
小鼠C2C12成肌细胞株(美国ATCC公司),过表达GLUT4myc的C2C12小鼠成肌细胞株(C2C12-GLUT4myc,与加拿大Amira Klip教授实验室合作建立),当GLUT4myc从胞质转位到细胞膜上转运葡萄糖进入细胞时,其myc表位暴露在胞外,可以用ELISA法简便的检测GLUT4myc转位(相当于检测葡萄糖摄取),避免了使用放射性同位素方法检测葡萄糖摄取。牛血清白蛋白(中国鼎国生物技术公司),DMEM和opti-MEM培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(以色列Bioind公司),瑞帕利辛(美国MCE公司),棕榈酸(美国Sigma公司),CCK-8试剂盒(爱必信),抗myc单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司),Trizol(美国Ambion公司)、逆转录试剂盒和qPCR Mix(北京TransGen Biotech公司),磷酸化Akt抗体、磷酸化AS160抗体和SOCS3抗体(美国CST公司),β-actin抗体(中国Abclonal公司),耦联HRP的山羊抗鼠抗体和耦联HRP的山羊抗兔抗体(美国JacksonImmuno Research公司),多聚甲醛(Biosharp生物科技公司),增强化学发光底物检测试剂盒(美国Millipore公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
分别将冻存的C2C12成肌细胞和C2C12-GLUT4myc细胞由液氮中取出,于37℃水浴中迅速融化,用含10%FBS的DMEM在37℃、5%CO2培养箱中培养,显微镜下观察细胞形态和生长密度,当细胞密度达到80%~90%时,即可传代接板。
1.2.2 CCK-8实验
将C2C12成肌细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中,细胞培养箱孵育24 h,然后分别加入0、100、200、300μmol/L PA或0、20、30、40μmol/L Reparixin孵育24 h,检测对C2C12成肌细胞活力影响,每孔避光加入10μL CCK-8试剂,细胞培养箱中孵育1 h,450 nm波长酶标仪检测吸光度。
1.2.3 免疫印迹
C2C12成肌细胞分为BSA组、PA组和PA+Reparixin组,分别用BSA、300μmol/L PA、300μmol/L PA+40μmol/L Reparixin孵育24 h,加或不加100 nmol/L胰岛素刺激10 min。提取各组细胞的总蛋白,并通过BCA蛋白测定法确定蛋白浓度。配制含有等量蛋白的样品,加入缓冲液(含有SDS),煮沸10 min使蛋白质变性。准备10%SDS-PAGE凝胶,并将样品及蛋白marker加到凝胶孔中。首先以80 V电压电泳至样品和marker开始分离形成清晰线条,调整电压至120 V,继续电泳直到样品至凝胶最底端。电泳后,使用湿转法将蛋白从凝胶转移到PVDF膜上。在110 V电压下进行转移2 h。电转后,用3%的BSA溶液在室温下封闭PVDF膜2 h。封闭结束后将PVDF膜按照蛋白分子量大小将目的条带切下,用含有一抗的孵育液(SOCS3的稀释比例为1 500,Akt、AS160为1 1 000,β-actin为1 5 000)覆盖膜,于4。C摇床上过夜孵育。随后,使用TBST清洗膜4次,每次10 min。加入对应的二抗溶液(1 5 000)室温摇床孵育2 h。再次用TBST清洗膜4次,每次10 min。使用显影仪,预冷30 min后,将显影液滴在PVDF膜上曝光,Image J软件分析条带。
1.2.4 ELISA
当GLUT4myc转运至细胞膜上后,其myc表位暴露于细胞外,可以用ELISA方便的检测,避免使用同位素等复杂方法。将C2C12-GLUT4myc细胞分为BSA组、PA组和PA+Reparixin组,分别用BSA、300μmol/L PA、300μmol/L PA+40μmol/L Reparixin孵育24 h,加或不加胰岛素刺激30 min(背景孔不做任何处理),检测不同组细胞GLUT4myc转位情况。加预冷的PBS+(500 m LPBS+1 m L 1 mol/L MgCl2+1 m L 1 mol/L CaCl2)洗两次,加入4%PFA(多聚甲醛)置于冰上10min,室温10min,PBS+洗两次,加入0.1 mol/L甘氨酸室温10 min,PBS+洗两次,加入5%山羊血清(GS)室温10 min后弃去,加入抗myc抗体,室温摇床1h,PBS+洗3次,每次5 min,加入耦联HRP的羊抗鼠二抗室温摇床1 h,PBS+洗3次,每次5 min,吸净PBS+,加入邻苯二胺(OPD)避光反应2 min,用3 mol/L HCl终止反应,避光静置2 min,吸取200μL上清,加到96孔板中,492 nm波长酶标仪测吸光度。所得OD值减去背景孔(仅用耦联HRP羊抗鼠二抗孵育)的OD值,计算其余各组OD值相对于对照组(设为1)的倍数,即为细胞膜GLUT4myc水平相对于对照组的倍数。
1.2.5 RNA提取和qRCR
将C2C12成肌细胞分为BSA组、PA组和PA+Reparixin组,分别用BSA、300μmol/L PA、300μmol/L PA+40μmol/L Reparixin孵育24 h,然后收集各组细胞检测不同分组RNA表达情况。各孔加入500μL Trizol裂解细胞,异丙醇沉淀法提取RNA。分光光度计检测RNA浓度,根据逆转录试剂盒操作步骤逆转录合成cDNA,将cD-NA、上下游引物、2×TransStart Tip Green Qpcr SuperMix混合成20μL的体系,使用LightCycler96运行程序。根据q PCR得出的荧光曲线的Ct值,以β-actin基因为内参,用2-ΔΔCt计算结果。所用引物序列见表1。
表1 扩增反应所需引物序列
1.3 统计学处理
使用GraphPad Prism8软件进行统计学分析,实验数据均重复3次及以上。符合正态分布的计量资料均以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 PA和Reparixin对C2C12成肌细胞活力的影响
PA孵育后C2C12成肌细胞的活力结果如图1A。0、100、200、300μmol/L的PA均不影响C2C12成肌细胞活力(F=2.717,P>0.05),选用300μmol/L PA作为后续实验浓度。Reparixin孵育后C2C12成肌细胞的活力结果如图1B。0、20、30、40μmol/L均不影响C2C12成肌细胞活力(F=2.018,P>0.05),选用40μmol/L作为后续实验浓度。
图1 PA和Reparixin对C2C12成肌细胞活力的影响
2.2 Reparixin对C2C12成肌细胞Akt和AS160磷酸化的影响
结果如图2所示,PA降低胰岛素磷酸化Akt和AS160的作用(均P<0.000 1),Reparixin逆转PA的影响(F=86.78、264.6,均P<0.0001)。
2.3 Reparixin对C2C12-GLUT4myc细胞GLUT4myc转位的影响结果
如图3所示,与BSA组相比,PA组胰岛素促进GLUT4myc转位的作用降低(P<0.0001),与PA组相比,PA+Reparixin组胰岛素促进GLUT4myc转位的作用显著升高(F=41.4,P<0.01)。2.4 Reparixin对C2C12成肌细胞SOCS3表达的影响结果如图4,与BSA组相比,PA组SOCS3 m R-NA和蛋白水平均显著升高(P<0.001,P<0.05)。与PA组相比,PA+Reparixin组SOCS3 m RNA和蛋白水平均显著降低(F=51.64、7.97,P<0.001,P<0.05)。
图2 免疫印迹检测C2C12成肌细胞Akt和AS160的磷酸化
图3 ELISA检测C2C12-GLUT4myc成肌细胞GLUT4myc转位
图4 C2C12成肌细胞SOCS3 m RNA和蛋白水平
3、讨论
本研究中探讨了Reparixin对PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的影响及其潜在机制。过量游离脂肪酸(FFA)造成的脂毒性是胰岛素抵抗的重要机制之一[7],其中又以饱和游离脂肪酸(SFAs)作用最为主要。研究表明,当SFAs在细胞内水平超过其线粒体氧化水平时,会转化为有害的脂质,如二酰甘油和神经酰胺。其中二酰甘油会激活蛋白激酶C(PKC),PKC通过抑制IRS-1的磷酸化损害胰岛素信号通路并且导致胰岛素抵抗,进而发展为2型糖尿病[8,9]。PA作为一种饱和脂肪酸,在过量时可诱导细胞内炎症和氧化应激,进而导致胰岛素信号通路受损和胰岛素抵抗的发展[10]。本研究用PA构建C2C12成肌细胞胰岛素抵抗模型[11],发现PA降低了胰岛素刺激的胰岛素信号通路蛋白的磷酸化,并且抑制了葡萄糖的摄取,表明PA成功诱导了C2C12成肌细胞胰岛素抵抗。而Reparixin逆转了PA的作用,提示Reparixin具有改善PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的作用,这是首次发现Reparixin对骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响。
胰岛素信号通路是调节机体糖代谢的关键机制,参与2型糖尿病和胰岛素抵抗的发生[12]。胰岛素通过结合其受体(IR)启动一系列下游信号转导事件,其中最为关键的是PI3K和Akt的激活[13]。Akt的激活进一步激活下游的AS160,AS160促进GLUT4转位至细胞膜,从而增加细胞对葡萄糖的摄取能力,维持血糖稳定[14]。在胰岛素抵抗状态,这一信号通路受到干扰,尤其是Akt激活的减弱,导致GLUT4转位和细胞对葡萄糖摄取的能力下降,最终导致血糖水平升高[15]。
GLUT4具有胰岛素敏感性,主要在骨骼肌和脂肪组织中表达,对于维持全身葡萄糖稳态至关重要[16]。在胰岛素作用下,GLUT4从胞内储存小泡快速转位至细胞膜,增加细胞表面GLUT4的数量,从而促进葡萄糖的摄取[17]。因此,任何影响Akt激活或GLUT4转位的因素都可能导致胰岛素抵抗的发展。本实验室构建过表达GLUT4myc的C2C12-GLUT4myc细胞株,检测GLUT4myc的转位,从而反映细胞的葡萄糖摄取情况。本研究发现Reparixin通过促进C2C12-GLUT4myc细胞GLUT4myc转位,恢复胰岛素信号通路的正常功能,改善了胰岛素抵抗状态。这一发现为进一步探索Reparixin在治疗2型糖尿病中的潜力提供了基础。
笔者进一步探讨了Reparixin改善C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的机制。SOCS3是一个关键的细胞内蛋白,其主要功能是通过抑制特定的细胞信号通路来调节细胞内信号转导[18]。SOCS3减弱IRS对胰岛素的响应,削弱胰岛素信号转导,抑制IRS-1-PI3K-Akt信号通路,从而导致胰岛素抵抗,抑制SOCS3有望成为治疗胰岛素抵抗以及2型糖尿病的新靶点[4]。有报道称胰岛素抵抗的肥胖动物肝脏SOCS3表达水平显著升高,肝脏中过表达SOCS3诱导全身胰岛素抵抗[19],抑制糖尿病小鼠肝脏SOCS3可使受损的胰岛素敏感性得到改善[20],同时,抑制SOCS3显著可改善肝脂肪变性[21]。以上研究表明SOCS3与胰岛素抵抗有关,并且抑制SOCS3的表达可以改善胰岛素抵抗。笔者的结果显示,PA升高C2C12成肌细胞SOCS3的m RNA和蛋白表达水平,表明其可能通过上调SOCS3水平诱发胰岛素抵抗,而Reparixin部分逆转了PA的作用,并且部分逆转PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗以及葡萄糖摄取,Reparixin可能通过抑制SOCS3基因表达,改善PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗。
综上所述,本研究发现Reparixin能够改善PA诱导的小鼠C2C12成肌细胞的胰岛素抵抗,并且Reparixin发挥作用的机制之一是抑制SOCS3基因的表达,证明Reparixin具有改善胰岛素抵抗的作用,并且SOCS3有可能成为治疗2型糖尿病的潜在靶点。
基金资助:国家自然科学基金面上项目(82270856);
文章来源:盛菲,倪钰鸽,牛文彦.瑞帕利辛改善棕榈酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗[J].天津医科大学学报,2024,30(04):338-342.
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