甘草(Gancao)始载于《神农本草经》[1],为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、 胀果甘草Glycyrrhiza inflataBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根茎[2]。 春、 秋二季采挖， 除去须根，晒干留用。甘草是我国常用的中药材，入药部位为根和根茎。其性平、 味甘，归心、肺、脾、胃经。 具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳之功效[3],临床应用于治疗脾胃虚弱、 心悸气短、 咳嗽痰多、 疮痈肿毒、 缓解药物毒性等[4]。研究表明， 甘草具有镇咳、抗菌[5]、抗炎[6]、抗过敏、抗氧化[7-8]、抗肿瘤[9]、抗癌、 灭病毒[10]、降血糖[11-12]、抗抑郁、解毒[13]等作用。

甘草中的化学成分主要有三萜类和黄酮类成分[14-15], 其中甘草酸和甘草苷的药用价值较高， 被2020年版《中国药典》确定为甘草质量鉴别的重要标志。其品种按国家药典认定的可分为乌拉尔甘草、 胀果甘草和光果甘草。 甘草喜欢生长于阳光充足、昼夜温差大的环境中， 在国内集中分布于新疆、内蒙古、宁夏、甘肃、山西朔州等地；国外则主要分布在亚洲、欧洲、澳洲、美洲等地。 品质优良的甘草通常需要3年时间才能采收，提前采摘会影响甘草酸和甘草苷的含量， 一些不良商家为了谋取暴采用劣质甘草以次充好，严重损害消费者权益， 影响中药材产业的健康发展， 开发一种用于鉴别甘草质量的方法具有重要意义。

近几年，甘草的质量鉴定方法主要包括性状鉴别、SNP分子标记技术鉴别、HPLC指纹图谱鉴别等， 传统的性状鉴别受主观因素影响大、 准确性低、 繁琐耗时长；SNP分子标记技术鉴别和HPLC指纹图谱鉴别方法虽然准确度高、 稳定性好但工作量较大、成本较高； 构建一种快速、准确、简便、便宜的鉴别甘草质量的检测方法十分重要。

红外光谱、荧光光谱和紫外-可见光谱等已广泛运用于食品和药材检测等。陈伟等使用交替三线性分解(ATLD)对白术三维荧光光谱进行表征， 再将三维荧光光谱与偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和k最邻近法(kNN)两种模式识别方法相结合对白术样品进行产地溯源。 童一洋等将NIRS技术与化学计量学结合， 建立了可用于检测复方甘草酸苷制剂的模型，为快速无损检测复方甘草酸苷制剂提供了参考[16]。 越南Nguyen Minh Quan等采用紫外-可见光谱结合偏最小二乘判别分析(PLS-DA)算法鉴定越南生咖啡豆的种类和地理来源[17]; 李宇等通过紫外-可见光谱技术并结合偏最小二乘回归法(PLSR)对烟草及烟草制品中葡萄糖和木糖含量的快速预测[18]。 吴晨璐等通过紫外-可见光谱和化学计量学方法建立一种快速检测双黄连口服液质量的方法[19]。 相对于红外光谱和荧光光谱， 紫外-可见分光光度更为方便、 便宜但特异性相对较差。

有研究者为了增加紫外-可见分光光度计的特异性， 在光谱的基础上加入能够特异性识别的探针， Guan等采用一种基于4-MPBA Au@AgNPs的比色传感器用于恩施玉露茶等级的准确鉴别[20]; Wu等提出了一种新型有机酸靶向比色传感器阵列， 用于快速鉴别三种主要香气类型的白酒来源[21];毛康等通过激光诱导荧光技术(LIF)采用特定荧光探针，完成对重金属的识别和检测[22]。紫外-可见光谱传感方法简单快速、 应用广泛， 根据文献查阅， 目前该方法还未应用于甘草品种和产地的快速分析。

本工作基于甘草的特征成分甘草酸和甘草苷能与有机染料及金属离子发生特异性光学反应的特性，通过紫外-可见光谱传感结合偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和随机森林(RF)算法对甘草品种和产地进行准确鉴别。 旨在为中国甘草在医药方面低成本和准确快速真实性鉴别方法的发展提供理论依据及参考。

1、实验部分

1.1 仪器与试剂

KQ-500DE型数控超声波清洗机(中国昆山超声仪器有限公司); UV-1800型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

酸性铬蓝K(ACBK)(上海麦克林生化科技股份有限公司)、 酸性媒介漂蓝B(CAB)(上海麦克林生化科技股份有限公司)、 羟基萘酚蓝二钠盐(HNBDS)(上海麦克林生化科技股份有限公司); 二甲酚橙二钠盐(XO)(上海源叶生物科技有限公司); 铬天青S(CAS)(上海罗恩化学技术有限公司)、 茜素红S(ARS)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 乙酸锌二水(分析纯， 国药集团化学试剂有限公司)、 二水合氯化铜(分析纯， 国药集团化学试剂有限公司)、 六水合三氯化铁(分析纯， 国药集团化学试剂有限公司); 无水氯化铝(98%, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、 氯化锆(≥99.9%, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司), 试剂均为分析纯。

所用甘草样品分别来自于新疆、宁夏、北京、内蒙古、乌兹别克斯坦五个产地，其中新疆的有乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草三个不同的品种，见表1。

表1 甘草样品详细信息

1.2 方法

1.2.1 金属离子-染料的配制

精密称定实验所需质量的药品，准确加入去离子水，摇匀至完全溶解，即得到实验所需要的金属离子-染料溶液： 酸性媒介漂蓝B(1×10-4mol·L-1)-Fe3+(1.4×10-4mol·L-1)、 羟基萘酚蓝二钠盐(5×10-5mol·L-1)-Cu2+(1×10-4mol·L-1)、 二甲酚橙二钠盐(7×10-5mol·L-1)-Zn2+(2×10-3mol·L-1)、 茜素红S(3×10-4mol·L-1)-Fe3+(1×10-3mol·L-1)、 铬天青S(2×10-4mol·L-1)-Al3+(1×10-4mol·L-1)、 酸性铬蓝K(7×10-5mol·L-1)-Zr4+(1×10-3mol·L-1)。

1.2.2 样品的制备与检测

取同一品种不同产地和同一产地不同品种的甘草，分别称量0.2 g样品， 用移液枪吸取10mL 70%的甲醇水溶液分别置于每个甘草样品中， 用超声波清洗机超声30 min, 微孔滤膜过滤， 得到澄清透明样品提取液。

再用去离子水分别稀释10倍， 用移液枪各移取400 μL的金属离子和有机染料按1∶1混合作为色变母液， 在色变母液中加入200 μL甘草提取液作为实验组， 同时在色变母液中加入200 μL去离子水作为空白组， 反应1 min后， 将实验组和空白组分别加入石英比色皿中， 使用紫外分光光度计进行紫外光谱数据的采集。 仪器参数设置： 波长200～800 nm, 波长间隔2 nm。

1.2.3 数据处理

使用软件MATLAB 2018b进行PLS-DA和RF分析， SIMCAl4.1进行OPLS-DA分析。

2、结果与讨论

2.1 甘草的紫外-可见光谱分析

甘草中含有三萜类、黄酮类及多糖和生物碱类多种化学成分，这些化学成分中存在有羰基、羧基、醚键、氰基、醛基等能够在紫外以及可见光区域内(200～800 nm)产生吸收的生色基团， 同时存在羟基、 甲氨基、 氨基、 烷氧基等能增强生色能力的生色团， 从而改变分子的吸收峰位置和增强助色基团的吸收强度。 不同品种和产地的甘草中甘草酸和甘草苷等主要成分的含量存在较大差异[23], 故能用紫外-可见光谱提取甘草品种和产地的差异信息。

图1(a, b)为不同品种和产地甘草的原始紫外-可见光谱， 3个品种和5个产地甘草的紫外-可见光谱只出现了一个吸收带(250～300 nm), 这个波段主要是由甘草中的甘草苷等成分引起。 甘草苷的主要分子结构包括了多个羰基、 羧基和苯环等结构， 当紫外光照射甘草提取液时， 甘草苷中的共轭键吸收所需的能量发生轨道跃迁， 从低能级转向高能级， 从而在260 nm处形成特征吸收谱带。 甘草中的甘草苷含量会受土壤、 生长环境、 种植时间、 品种、 储存、 加工和种植技术等多种因素的影响， 因此不同品种和产地甘草的甘草苷含量存在差异。 由图1(a, b), 不同品种和产地甘草的紫外-可见光谱均存在一定的差异。 纯紫外-可见光谱法对甘草品种和产地的区分具有一定的效果。

图1(c, d)为甘草样品紫外-可见光谱图的PLS-DA分类结果， 在甘草品种分类中胀果甘草能与光果甘草和乌拉尔甘草分开， 而光果甘草和乌拉尔甘草不能分离， 在产地分类中， 所有产地的乌拉尔甘草都无法分离。 原因可能与胀果甘草和其他品种甘草的甘草酸和甘草苷含量相差较大有关。 早期研究发现， 栽培3年生和栽培4年生甘草的甘草酸含量大小顺序为： 乌拉尔甘草>胀果甘草>光果甘草， 甘草的甘草苷含量大小顺序为： 乌拉尔甘草(0.41%)>光果甘草(0.31%)>胀果甘草(0.17%), 乌拉尔甘草与光果甘草甘草苷含量相近。

PLS-DA方法常用于样品的分类和鉴别， 其中R2Y表示所构建的模型对矩阵的解释比例，Q2表示该模型的预测性能， 当数值越接近1时， 表示模型的拟合程度越高， 模型的稳定性和可靠性越强， 样本越能准确划分到原始类， 通常Q2>0.5时可默认为模型有效，Q2>0.85时可认为模型结果较好。 通过PLS-DA对纯紫外-可见光谱的甘草分类效果进行分析， 结果显示[图1(c, d)], 品种和产地的分类中R2Y和Q2均分别大于0.95和0.75, 即纯紫外光谱可对甘草的品种和产地进行初步鉴定。

图1 不同品种和产地甘草的紫外-可见光谱和PLS-DA分类结果

2.2 紫外-可见光谱传感的构建和优化

为了进一步提高甘草品种和产地的分类效果，在纯紫外-可见光谱检测中， 加入能与甘草酸和甘草苷作用的有机染料和金属离子。 有机染料作为一种具有较大共轭结构的分子， 种类繁多、 光学性质好、 选择性好等， 在溶液中可与分子相互作用产生明显的颜色变化。 如果在其中引入特殊的功能基团或金属离子， 并将其与待测物质复合， 则可以实现被测成分的准确识别。 与纳米材料、 单量子点相比， 有机染料在稳定性、 重现性等有较大的优势。 因此有机染料是一种极具潜力的检测手段。

为了筛选传感体系中的有机染料与金属离子，将酸性媒介漂B(chrome pure blue BX, CAB)、 羟基萘酚蓝二钠盐(hydroxy naphthol blue disodium salt, HNBDS)、 二甲酚橙二钠盐(xylenol orange disodium salt, XO)、 茜素红S(alizarin red S, ARS)、 铬天青S(chromeazurol S, CAS)、 酸性铬蓝K(acid chrome blue K, ACBK)等6种有机染料分别与Fe3+、 Zn2+、 Cr3+、 Co2+、 Ca2+等多种不同的金属离子进行反应并测定其紫外-可见光谱数据。 根据实验结果分析(图2, 图3), 该6种有机染料均能与不同金属离子反应并引起不同程度光谱变化。 图2是酸性媒介漂蓝B(CAB)与几种不同金属离子以及加入样品后的紫外-可见光谱， 可以观察到只有铁离子加入样品后与原传感点吸光度有明显变化， 其余离子吸光度与波长变化都不明显， 后半段几乎重叠， 极有可能是因为Fe3+能与甘草中的甘草苷和甘草酸反应， 从而影响了其中生色团和助色团的结构导致波长和吸光度的变化。 选择Fe3+与CAB组成传感点， 其他传感点以类似方式筛选出， 从而构建识别甘草的紫外-可见传感阵列。

图3(a—f)是优化后的6种金属离子-染料传感与甘草提取物相互作用的紫外-可见光谱， 6种有机染料在加入相配对的金属离子后均发生不同程度的红移， 最大吸收波长也有所变化， 说明有机染料与金属离子发生了相互作用。 继续加入甘草样品后各传感点产生了蓝移， XO、 ARS、 CAS中加入配对金属离子后， 发现最大吸收波长蓝移明显， 有向有机染料恢复的趋势。 而有机染料CAB、 HNBDS、 ARS也发生了蓝移， 虽然相对于前3种有机染料现象较弱但也能够观察到此现象。 说明甘草提取液可能与染料竞争金属离子发生不同程度的作用产生谱峰变化， 但甘草提取液可能对某些染料中的金属离子竞争能力较弱， 因此产生的蓝移现象并不明显。

图2 不同金属离子对有机染料传感的响应光谱

图3 六种传感材料对甘草的响应光谱

2.3 紫外-可见光谱传感对甘草品种及产地的鉴别

甘草中的化学成分包括三萜类、黄酮类、香豆素、多糖、有机酸、生物碱、氨基酸等，而黄酮和三萜皂苷类化合物的主要活性成分为甘草苷和甘草酸，是甘草的主要特征成分，是用来鉴定甘草的重要依据。这些化合物具有能与金属离子发生强烈相互作用的中心元素，化合物中的N、 O含有孤对电子， 具有与金属离子空轨道配位的潜力， 很容易与大多数过渡金属离子形成相当稳定的络合物。 其次， 染料分子结构中具有羧基、 羟基、 氨基等基团， 其孤对电子也易于与金属离子中的空轨道配位， 形成络合物并具有颜色的变化。 由图4可以看出甘草中的化合物与有机染料竞争配位金属离子从而导致光谱的变化， 为区分品种和产地提供了更多的差异信息。

为了衡量紫外-可见光谱传感对甘草品种和产地的鉴别效果， 对不同品种和产地甘草提取液与金属离子-染料作用后的紫外-可见光谱图进行扫描。 结果显示[图4和图5(a—f)], 相比于甘草原始紫外-可见光谱， 加入了传感材料后的紫外-可见光谱有明显差异。 除原始紫外可见光谱在200～400 nm处提供了差异外， 传感光谱在450～600 nm提供了更为丰富的差异信息。 对甘草不同品种的鉴定效果优于不同产地的鉴定效果， 在不同品种的传感光谱中CAB的鉴定效果最好， 在450～700 nm都有明显的差异， HNBDS和ACBK的鉴定效果次之， 虽不如CAB明显但也能分开， 在400～700 nm都有一定差异， 而XO、 ARS、 CAS效果最差， 在400～500 nm有差异， 在500～700 nm出现重叠， 无法以肉眼鉴别。 在不同产地的传感光谱中， CAB和ACBK染料鉴定效果最好， 在450～600 nm中都有明显的光谱差异； HNBDS和XO次之， 只在460～500 nm附近存在差异； 而ARS和CAS效果最差， 在400～700 nm附近出现部分重叠。 图5(a—f)和图6(a—f)中可以观察到染料HNBDS、 XO、 CAS在500～600 nm处都出现波峰， 推测可能是由于甘草中的特征成分甘草苷和甘草酸与有机染料竞争金属离子发生相互作用而导致。

图4 甘草中化合物与金属离子-染料反应机制图

图5 六种传感材料对不同品种甘草的响应光谱

图6 六种传感材料对不同产地甘草的响应光谱

2.4 化学计量学分析

为了更好地提高金属离子-有机染料传感阵列对甘草的识别能力， 结合了化学计量学中的RF和PLS-DA模型建立甘草品种及产地识别方法。

由表2与图7(a, b)可知， 在PLS-DA和RF模型中6种有机染料的总体判别准确率均达到了100%, 其中RF模型明显要优于PLS-DA模型， 在RF模型中， 除CAS-Al3+的产地预测集为98.65%, 其余传感点的预测集和训练集均为100%, 品种和产地的预测集准确率均在90%以上。 在PLS-DA模型中， 各传感材料鉴别效果从大到小分别为CAB-Fe3+≈HNBDS-Cu2+>XO-Zn2+>ARS-Fe3+>CAS-Al3+>ACBK-Zr4+。 CAB-Fe3+、 HNBDS-Cu2+的判别结果最优， 其预测集和训练集判别结果准确率均达到100%, XO-Zn2+、 ARS-Fe3+、 ACBK-Zr4+次之， CAS-Al3+判别结果最差， 产地的预测集和训练集准确率分别为91.30%和96.15%, 原始提取液品种和产地的预测集准确率为66.67%和65.22%, 其准确率皆明显低于RF模型。 虽然PLS-DA模型判别结果准确率低于RF模型， 但融合了6种有机染料的传感光谱在PLS-DA模型中的判别结果仍优于单独有机染料传感和原始样品提取液。 虽然传感阵列可能会受到多种因素的干扰导致模型的预测结果偏低， 从多方面考虑， 融合光谱的整体准确度仍比较高， 可发现整体对品种和产地的判别结果均能达到100%, 远优于原始光谱的判别结果。 因此采用有机染料与金属离子构建融合光谱传感可实现甘草品种及产地的准确鉴别。

表2 不同传感体系对甘草的PLS-DA和RF鉴别结果的比较

3、结论

采用有机染料与金属离子构成的阵列传感点结合紫外-可见光谱与PLS-DA和RF算法对不同品种与不同产地的甘草进行快速判别。 与直接测定样品提取液原始光谱相比， 本方法为甘草的光谱测定提供了更多的有效信息， 使紫外-可见传感光谱有明显差异， 提高了不同品种和产地甘草的鉴定效果。 通过金属离子-染料传感结合PLS-DA和RF两种算法将不同品种和产地甘草的判别准确率分别从原来的66.67%和65.22%提高到100%, 融合后的光谱传感明显优于单个传感点的判别效果。 本方法具有性质稳定、 响应快速、操作简便、 准确性好、 灵敏度高、 成本低廉等优点， 结合便携式光谱仪， 有望实现甘草品质的现场快速鉴别， 可为中药材贸易中以次充好问题提供快速评价方法， 促进传统中药产业的健康发展。

图7 甘草分类的PLS-DA矢量编码图

基金资助:国家自然科学基金项目(22378433); 中南民族大学中央高校基本科研业务费(YZY22001,CZQ23005)资助;

文章来源:胡爱芬,黄云,任理雪,等.紫外-可见光谱传感对甘草品种及产地的准确鉴别[J].光谱学与光谱分析,2024,44(09):2647-2656.