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连翘苷对呼吸道合胞病毒感染小鼠的治疗作用

2024-08-12 36 上传者：管理员

摘要：目的探讨连翘苷对呼吸道合胞病毒（RSV）感染小鼠Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）信号通路的影响。方法用RSV滴鼻感染法构建呼吸道感染模型，将RSV感染小鼠随机分为模型组、实验组及阳性对照组，另对照组小鼠给予等量的DMEM培养基滴鼻。实验组小鼠灌胃给予200 mg·kg-1·d-1连翘苷，阳性对照组小鼠灌胃给予27.6 mg·kg-1·d-1利巴韦林，对照组与模型组均灌胃给予等量0.9%NaCl,连续干预14 d。用酶联免疫吸附试验法检测肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素-4（IL-4）、IL-13及γ-干扰素（INF-γ）水平，用实时荧光定量聚合酶链反应法检测肺组织TLR4、MyD88 mRNA的转录水平，用免疫组织化学法检测肺组织TLR4、MyD88蛋白的阳性表达情况。结果对照组、模型组、实验组及阳性对照组小鼠BALF中IL-4水平分别为（490.63±27.45）、（1 382.37±41.28）、（970.32±36.01）和（738.41±30.27）pg·mL-1,IL-13水平分别为（4.02±2.63）、（18.33±5.62）、（12.97±3.73）和（7.51±2.74）pg·mL-1,INF-γ水平分别为（54.42±2.68）、（30.26±4.68）、（42.80±3.36）和（45.01±3.82）pg·mL-1,肺组织TLR4 mRNA相对表达水平分别为0.43±0.06、1.63±0.12、0.98±0.10和0.86±0.06,肺组织MyD88 mRNA相对表达水平分别为0.56±0.09、1.78±0.15、1.02±0.07和0.75±0.06,肺组织TLR4蛋白平均光密度值分别为0.02±0.00、0.11±0.02、0.06±0.01和0.03±0.00,MyD88蛋白平均光密度值分别为0.01±0.00、0.09±0.02、0.05±0.01和0.03±0.01。模型组的上述指标与对照组比较，实验组和阳性对照组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论连翘苷可减轻RSV感染小鼠的肺损伤，可能与调节免疫细胞的平衡，抑制TLR4/MyD88信号通路有关。

关键词：
Toll样受体4
呼吸道合胞病毒
炎症反应
连翘苷
髓样分化因子88
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呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿急性呼吸道感染的最常见原因，占5岁以下儿童呼吸道感染的46.9%,给家庭和社会造成严重的经济负担[1]。目前，临床治疗RSV感染的抗病毒药物主要是利巴韦林，但其细胞毒性较大，疗效备受争议[2]。中医药防治病毒感染性疾病优势独特，疗效显著，安全性较高，发展和应用前景广阔[3]。连翘苷是连翘的重要活性成分，具有抗炎、抗病毒、调节免疫、抗氧化等功效，可有效抑制与急、慢性炎症相关的多种组织器官损伤[4]。本研究旨在探讨连翘苷能否经Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)通路改善RSV刺激的小鼠肺组织炎症反应。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级BALB/c雄性小鼠，鼠龄7周，体质量20～22 g, 购自上海灵畅生物科技有限公司。动物许可证号：SCXK(沪)2018-0003。本实验经乐山职业技术学院医学伦理委员会批准(伦理批号：20230420)。

细胞与病毒人喉癌细胞系(Hep-2),购自武汉普诺赛生命科技有限公司；RSV A型Long株，由武汉大学国家典型培养物保藏中心提供。

药品与试剂连翘苷，规格：每瓶200 mg, 纯度：HPLC≥98%,批号：Z17A8X34077,上海源叶生物科技有限公司生产；利巴韦林注射液，规格：每支1 mL/0.1 g, 批号：1912232252,批准文号：国药准字H19993512,辰欣药业股份有限公司生产。白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)、IL-13酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均由杭州联科生物技术股份有限公司生产；干扰素-γ(interferon gamma, INF-γ)试剂盒，上海远慕生物科技有限公司生产；TLR4抗体、MyD88抗体，均由美国Abcam公司生产。

仪器BX51光学显微镜，日本Olympus公司产品；Motic Advanced 6.0图像分析软件，厦门麦克奥迪软件系统工程有限公司产品。

2 实验方法

2.1 RSV繁殖[2]

将RSV A型Long株接种于Hep-2细胞上，使其在Hep-2细胞中扩增，扩增后反复冻融3次制备RSV A型Long株悬液，计算半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose, TCID50),本研究用的RSV A型Long株的TCID50为1×10-4.385·50 μL-1。

2.2 模型构建、动物分组与给药方法[2,5]

用RSV滴鼻感染BALB/c小鼠的方法构建RSV感染小鼠模型[5]:以乙醚麻醉小鼠后，吸取100 TCID50的RSV A型Long株悬液双侧鼻腔滴注，每侧25 μL,连续3 d; 若小鼠出现进食减少、体温升高、精神萎靡、活动减少等现象，表示造模成功。

将构建的RSV感染小鼠随机分为模型组、实验组及阳性对照组，另对照组小鼠予等量的DMEM培养基滴鼻，每组15只。实验组小鼠给予200 mg·kg-1·d-1连翘苷灌胃干预，阳性对照组小鼠给予27.6 mg·kg-1·d-1利巴韦林灌胃干预，对照组与模型组均灌胃等量0.9%NaCl, 连续干预14 d。

2.3 ELISA法检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中炎性因子水平[2]

末次干预结束后麻醉处死小鼠，进行气管插管，结扎左肺，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)灌洗右侧肺(0.5 mL),收集BALF,共6次。将收集的BALF,于4 ℃下，以2 500 r·min-1离心5 min, 取上清液，用ELISA法检测BALF中IL-4、IL-13、INF-γ水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.4 苏木精-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色法观察小鼠肺组织病理学变化[2]

收集BALF后，取左肺，用4%多聚甲醛固定24 h, 经脱水、包埋、切片等制作肺组织石蜡切片，行常规HE染色，于光学显微镜下观察小鼠肺组织损伤情况及炎性细胞浸润情况。

2.5 实时荧光定量聚合酶链反应法(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测肺组织TLR4、MyD88 mRNA相对表达水平的变化[5]

取冻存肺组织，加入TRIzol试剂提取总RNA,反转录成cDNA,用荧光定量PCR仪检测TLR4和MyD88 mRNA表达，以β-actin为内参，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量水平。

2.6 免疫组织化学法检测肺组织TLR4、MyD88蛋白的表达情况[5]

取肺组织石蜡切片，实验操作严格按照试剂盒说明进行。分别加入一抗(TLR4抗体、MyD88抗体),4 ℃孵育过夜；加入二抗，室温孵育30 min, 苏木精复染，封片。在光学显微镜下观察TLR4、MyD88蛋白阳性表达情况，以胞质中有棕黄色颗粒为阳性表达，用Image-Pro Plus 6.0分析软件进行半定量分析，计算平均光密度值。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以

表示，符合正态分布且方差齐时，2组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析；不符合正态分布时，用秩和检验分析。

二、结果

1 各组小鼠肺组织病理学变化

实验组小鼠给予200 mg·kg-1·d-1连翘苷；阳性对照组小鼠给予27.6 mg·kg-1·d-1利巴韦林；对照组与模型组均给予等量0.9%NaCl。

HE染色显示：对照组小鼠肺组织结构完整，肺泡结构清楚，肺泡壁薄无充血，且肺间质无炎性细胞浸润；模型组小鼠肺泡变小，肺泡壁破坏、增厚，肺间质伴有大量炎性细胞浸润；实验组与阳性对照组小鼠肺组织病变明显改善，肺泡腔增大，肺泡壁明显变薄，同时肺间质炎性细胞浸润明显减少，且以阳性对照组改善最佳。结果见图1。

2 各组小鼠BALF中炎性因子水平的比较

模型组与对照组比较，小鼠BALF中IL-4、IL-13水平均显著升高，INF-γ水平均显著降低(均P<0.05);实验组与阳性对照组的IL-4、IL-13水平均较模型组显著降低，INF-γ水平均较模型组显著上调，且阳性对照组效果最为显著(均P<0.05)。结果见表1。

3 各组大鼠肺组织TLR4和MyD88 mRNA的表达情况

对照组、模型组、实验组及阳性对照组小鼠肺组织TLR4 mRNA相对表达水平分别为0.43±0.06、1.63±0.12、0.98±0.10和0.86±0.06,MyD88 mRNA相对表达水平分别为0.56±0.09、1.78±0.15、1.02±0.07和0.75±0.06;模型组与对照组比较，大鼠肺组织中TLR4和MyD88 mRNA相对表达水平均显著上调(均P<0.05);实验组和阳性对照组的TLR4和MyD88 mRNA相对表达水平均较模型组显著降低(均P<0.05),且阳性对照组下调程度最为显著。

图1在光学显微镜下观察肺组织苏木精-伊红(HE)染色(×200)

表1各组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎性因子水平的比较

4 各组小鼠肺组织TLR4、MyD88蛋白的表达情况

对照组、模型组、实验组及阳性对照组小鼠肺组织TLR4蛋白平均光密度值分别为0.02±0.00、0.11±0.02、0.06±0.01和0.03±0.00,MyD88蛋白平均光密度值分别为0.01±0.00、0.09±0.02、0.05±0.01和0.03±0.01。模型组与对照组比较，小鼠肺组织中TLR4与MyD88蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05);实验组与阳性对照组的TLR4和MyD88蛋白相对表达水平均较模型组显著下调(均P<0.05)。结果见图2。

图2各组小鼠肺组织中Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)蛋白的阳性表达(×200)

三、讨论

RSV是引起婴幼儿下呼吸道及肺部感染的主要病原体，RSV感染呼吸道后通过诱导上皮细胞分泌细胞因子、趋化因子等炎性介质，可引起气道炎症[6-7]。由于西医治疗RSV感染的局限性，近年来，中医药治疗RSV感染逐渐引起关注，多种传统中药或中药提取物均具有明显的抗病毒、抗菌与抗炎等作用[8]。连翘苷作为一种中药天然化合物，具有广泛的抗炎、抗病毒及调节免疫的作用[9]。郭健敏等[10]研究发现，连翘苷是抗呼吸道病毒的有效物质，可明显改善流感病毒诱导的肺组织病毒性间质性肺炎的病变。研究发现，连翘苷能减轻肺炎克雷伯菌感染导致的肺组织损伤[11]。本研究用RSV滴鼻法构建呼吸道感染小鼠模型，探讨连翘苷对肺损伤的保护作用，结果显示，RSV感染可导致肺组织结构破坏，肺泡壁增厚，炎性细胞浸润，而连翘苷可改善肺泡壁断裂、融合等病变，无明显出血，可见少量炎性细胞浸润。这提示连翘苷可减轻RSV感染诱导的肺组织炎症反应进程。

IL-4、IL-13主要由Th2细胞亚群分泌，其表达升高提示Th2细胞比例升高，即Th1/Th2失衡，由此介导了RSV感染的毛细支气管炎的发生[12]。IFN-γ等因子由Th1细胞分泌产生，从而升高Th1/Th2比例来拮抗炎症[13]。胡亚静等[14]研究表明，RSV可引起小鼠BALF中Th2细胞因子IL-4、IL-13的分泌增多，Th1细胞因子IFN-γ水平降低，Th1/Th2细胞比例失衡。本研究结果表明，RSV可引起Th1/Th2失衡，给予连翘苷治疗后可调节Th1/Th2的平衡，减轻RSV引起降低炎症反应。

TLRs是天然免疫的重要组成部分，可通过识别多种病原微生物的病原分子相关模式在炎症反应和信号转导方面起重要作用，参与RSV感染的发展过程，而TLRs可通过调节MyD88途径进一步加重炎症损伤[15]。许玲芬等[16]研究发现，RSV感染能明显促进小鼠肺组织TLR4、MYD 88蛋白的表达，加重炎症反应及肺组织损伤。本研究中，感染RSV的小鼠肺组织TLR4与MyD88转录水平及蛋白相对表达水平均显著升高，连翘苷治疗可降低TLR4与MyD88 mRNA及蛋白的表达，这提示连翘苷可能通过抑制TLR4/ MyD88信号通路的表达来减轻RSV感染小鼠的肺损伤。

本研究提示，连翘苷可以减轻RSV感染小鼠的肺损伤，其机制可能与调节免疫细胞的平衡，抑制TLR4/MyD88信号通路，增强机体免疫功能有关。

参考文献:

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[3]李华,吴锦雯,周雅萍.中医药对呼吸道病毒作用的最新研究进展[J].中国临床药理学杂志,2020,36(17):2725—2727,2731.

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[9]李丽梅,于虹敏,黄美霞,等.基于网络药理学与实验验证探讨连翘苷治疗脓毒症的作用及机制[J/OL].中药药理与临床,2023:1—20.2023-09-01[2024-01-15].

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[16]许玲芬,李英兰,王佳斌,等.基于TLR4-NF-κB通路的槲皮素对病毒性呼吸道感染小鼠免疫功能的影响及抑炎作用研究[J].中药药理与临床,2023,39(6):53—57.