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中药成分巴马汀在5个种属肝微粒体中的代谢特征

2024-08-14 91 上传者：管理员

摘要：目的：研究巴马汀在5个种属的体外肝微粒体代谢差异。方法：采用体外肝微粒体温孵法，在正离子模式下，通过超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析比较巴马汀在狗肝微粒体（DLM）、人肝微粒体（HLM）、小鼠肝微粒体（MLM）、猴肝微粒体（MKLM）和大鼠肝微粒体（RLM）的体外代谢途径，流动相0.1%甲酸铵的水溶液-乙腈梯度洗脱。结果：巴马汀的5个种属体外肝微粒体代谢中，鉴定了11个代谢产物，其中DLM 3个，HLM 8个，MLM 2个，MKLM 3个，RLM 4个，其代谢途径主要是脱甲基化、羟基化、羟基化、脱氢化、甲基化、羟基化。结论：种属间的肝微粒代谢存在差异性，为进一步研究巴马汀体内代谢安全性提供依据。

关键词：
UPLC-Q-TOF-MS
中药
巴马汀
肝微粒体
超高效液相色谱-飞行时间质谱
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夏天无为江西道地药材，是临床上常用的中药，其主要有效成分为生物碱，巴马汀属于异喹啉类生物碱是其主要成分之一[1-2]。现代药理研究发现巴马汀具有抗炎、抗菌、抗病毒和降血糖等药理作用[3]，临床上将其应用于治疗肠炎、关节炎和妇科炎症等方面[4]。近年来，国内外关于生物碱药理作用进行广泛研究，但对异喹啉类生物碱的体外肝微粒体代谢研究报道比较少[5]。然而，肝微粒体体外代谢模型是体外药物代谢研究最经典、常规方法之一，因肝微粒体代谢研究具有方便和有效性[6]，被广泛应用于确定药物的代谢途径、制备代谢物、种属代谢差异性等研究[7]。因此，本实验采用采用体外肝微粒体温孵方法结合超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术分别对巴马汀在5个种属狗肝微粒体（DLM）、人肝微粒体（HLM）、小鼠肝微粒体（MLM）、猴肝微粒体（MKLM）和大鼠肝微粒体（RLM）的代谢产物进行分析[8]，并通过代谢产物的一级及二级碎片的精确分子量信息进行代谢鉴定，确定其代谢途径[9]。通过本实验研究可以阐明巴马汀在5个不同种属肝微粒体中的代谢差异，为探究生物碱类体内用药以及其临床上用药的安全和有效性提供依据。

1、材料

巴马汀（实验室自制，纯度>98%）；肝微粒体（狗、人、小鼠、猴、大鼠均由BD公司提供）；磷酸缓冲液（PBS）缓冲液（武汉鼎国公司）；水（娃哈哈饮用水有限公司）；色谱乙腈、色谱甲醇；甲酸铵（美国Fisher公司）；其余试剂均为分析纯。

TOF 5600+型飞行时间高分辨率质谱仪（AB SCIEX公司）；离心机（德国赛默飞世尔公司）；MTV-100型多管漩涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）；MTN-28000型氮气吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；Sartorious BT25S型十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2、方法

2.1 肝微粒体制备

分别精确称取化合物巴马汀3.52 mg配成浓度都为1.00 mmoL/L;PBS缓冲液配制成1.00 mmoL/L；取5个种属（狗、人、小鼠、猴和大鼠）肝微粒体分别配成浓度为1.00 mg/mL，还原辅酶Ⅱ四钠盐（NADPH）溶液配成1.00 mmoL。

2.2 样品制备

分别用移液枪取20μL巴马汀溶液，10μL狗、人、小鼠、猴和大鼠肝微粒体溶液，150μL PBS溶液于PE管中，混匀，各制备得到2个样品（分别为阳性和对照样品），于37℃水浴预孵育5 min。阳性样品加入20μL启动因子NADPH溶液，空白对照样品加等量PBS溶液，37℃下孵育60 min，加400μL乙腈终止反应，漩涡沉淀蛋白后，14 000 r/min离心10 min，取上清液，氮气吹干，加200μL的20%乙腈-水复溶，并在4℃下14 000 r/min高速离心10 min，取上清液20μL进行UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.3 分析条件

2.3.1 质谱条件

离子源为电喷雾离子化源，正离子模式；喷雾电压：4 500 V，温度：600℃，气帘气：25 psi，雾化气和辅助气：50 psi，去簇电压：100 V，碰撞能量：40 eV，碰撞能量叠加：10 eV。

2.3.2 液相条件

色谱柱：Waters SunFire C18柱（3.5μm,100 mm×2 mm）；柱温45℃；流动相：0.1%甲酸铵水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱为0.0～2.5 min,A 95%～95%;2.5～10.0 min,A 95%～50%;10.0～12.5 min,A 50%～50%;12.6～17.0 min,A 50%～10%;17.1～20.0 min,A 95%～95%；流速：0.25 mL/min；进样体积：20μL。

2.4 数据处理

采用PeakView 1.6软件对数据进行处理。

3、结果

巴马汀原型药的保留时间为9.58 min，一级图谱中分子离子峰为[M]+m/z 352.155 0，其二级特征碎片离子主要为m/z 336.121 6、322.106 7、308.127 1、294.111 2和278.080 3。基峰碎片离子m/z336.121 6是由于原型药物丢失16 Da;m/z 336.121 6继续丢失14 Da得到碎片离子m/z 322.106 7,m/z 322.106 7继续丢失14 Da得到碎片离子m/z308.127 1；碎片离子m/z 294.111 2是由于m/z308.127 1丢失14 Da得到；从丢失的分子量和二级质谱碎片，可以推测巴马汀原型药主要裂解途径。见图1、图2。

图1 巴马汀质谱图

注：A.巴马汀EIC图；B.一级质谱图；C.二级质谱图。

图2 巴马汀二级质谱裂解途径

巴马汀为季铵型生物碱类化合物，该化合物在正离子模式响应较高。因此，本文将采用正离子模式下对巴马汀在5个种属肝微粒体的代谢产物进行研究，并建立巴马汀的质谱裂解规律，将其质谱规律应用于寻找可能的代谢产物的特征色谱峰，再以该离子作为前体离子，进行二级质谱与原药的特征碎片离子比较，找到代谢规律，最后通过与空白样品对照，结合精确质量数和分子式预测软件，确定其代谢物的裂解途径[9-10]。原药巴马汀在5个种属（狗、人、小鼠、猴、大鼠）的肝微粒体代谢产物中共鉴定11个。包括狗肝微粒体代谢产物为2个（M2、M3），如图3A；人肝微粒体代谢产物为8个（M1、M2、M3、M4a、M4b、M4c、M4d、M5），如图3B；小鼠肝微粒体代谢产物为2个（M2、M3），如图3C；猴肝微粒体代谢产物为3个（M1、M2、M3），如图3D；人肝微粒体代谢产物为5个（M2、M3、M5、M6a、M6b），如图3E；其代谢途径主要包括脱甲基化（M1）、羟基化（M4a-4d）、羟基化和脱氢化（M2、M5、M6a、M6b）、甲基化和羟基化（M3）。见表1和图4。

表1 巴马汀在5个种属中的11代谢产物

图3 巴马汀的总提取离子色谱图

图4 巴马汀在狗、人、小鼠、猴和大鼠肝微粒体中的代谢途径

M2：在正离子模式下，M2的准分子离子峰为[M]+m/z 366.170 0，比巴马汀的[M]+m/z352.155 0多14 Da，其二级质谱的主要特征碎片离子为m/z 350.140 3、322.143 7、308.127 4和292.095 9。M2的碎片离子m/z 350.140 3比原型M的碎片离子m/z 336.122 7多14 Da，碎片离子m/z 322.143 7、308.127 4和292.095 9与原型一样，故推测M2为羟基化和脱氢化产物，分子式为C21H20NO5+，其结构见图5B。且这个代谢产物在5个种属的肝微粒体（狗、人、小鼠、猴、大鼠）肝微粒体中都能被检测到。

M3：在正离子模式下，M3分子离子峰为[M]+m/z 396.217 0，比巴马汀的[M]+m/z 352.155 0多44 Da，其二级质谱的主要特征碎片离子为m/z352.155 2、308.128 5和292.096 3,M3的碎片离子m/z 352.155 2比原型M的碎片离子m/z 308.1283多44 Da,M3的碎片离子m/z 292.096 3和原型一样，故推测M3为甲基化和羟基化产物，分子式为C23H26NO5+，其结构见图5C。与M2类似，M3代谢产物也在5个种属的肝微粒体（狗、人、小鼠、猴、大鼠）中都能被检测到。

M4a-4d：在正离子模式下，M4a、M4b、M4c、M4d分子离子峰为[M]+m/z 368.149 3，均比巴马汀的[M]+m/z 352.155 0多16 Da，其保留时间分别为8.47、9.33、10.14和11.82 min，其二级质谱的主要特征碎片离子为m/z 336.126 4、322.106 8、308.130 0和294.117 6。M4a、M4b、M4c和M4d的碎片离子m/z 294.117 6比原型M的碎片离子m/z278.081 2多16 Da，其他碎片离子与原型一样，故推测M4a、M4b、M4c、M4d为4个同分异构体的羟基化产物，分子式为C21H22NO5+，其结构可见图5D。且这4个代谢产物仅在人肝微粒体中被检测到。

M5：在正离子模式下，M5的准分子离子峰为[M]+m/z 398.159 8，比巴马汀的[M]+m/z352.155 0多46 Da，其二级质谱的主要特征碎片离子为m/z 380.149 9、322.111 8和294.114 8，均与M2碎片离子一样，故推测M5为羟基化和脱氢产物，分子式为C21H20NO7+，其结构见图5E。且代谢产物M5在人和小鼠肝微粒体中被检测到。

M6a和M6b：在正离子模式下，M6a和M6b的准分子离子峰为[M]+m/z 382.201 3，比巴马汀的[M]+m/z352.155 0多30 Da，其二级质谱的主要特征碎片离子为m/z 352.153 4、308.126 9和294.105 3,M6a和M6b的碎片离子m/z 352.153 4比m/z 322.107 6多30 Da，其他碎片离子m/z 308.126 9、294.105 3与原型一样，故推测M6a和M6b为羟基化和脱氢化产物，分子式为C21H20NO6+，其结构见图5F。且这两个代谢产物只在人肝微粒体中被检测到。

图5 巴马汀所有代谢产物的二级质谱图

4、讨论

本文应用UPLC-Q-TOF-MS系统讨论了巴马汀在5个种属（狗、人、小鼠、猴和大鼠）的体外肝微粒代谢的差异，通过分析代谢产物的碎片离子信息，对它们的结构和代谢途径进行鉴定。进一步比较巴马汀在5个种属的体外肝微粒体代谢产物，发现种属间的体外肝微粒代谢存在一定的差异性，且人与猴的代谢更接近。提示在设计、实施巴马汀化合物的体内代谢试验研究，尤其是临床试验时，应充分考虑到动物实验与人在其代谢方面的异同，降低药物代谢种属差异对人体的潜在风险[12]。通过对其结构的解析，进一步完善体外肝微粒代谢途径[13]，这不仅为研究药代动力学的安全性提供参考依据，而且也为其他潜在有效活性生物碱的临床研究及开发提供依据。

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基金资助:江西省药品监督管理局科研项目(2020JS10);

文章来源:廖惠平,谢勇辉,刘晓,等.中药成分巴马汀在5个种属肝微粒体中的代谢特征[J].江西中医药大学学报,2024,36(04):72-76.