目前，市场热销的百合品种有卷丹、兰州百合、龙牙百合（正式学名应为百合[1]）和岷江百合。其中，卷丹具有润肺止咳、清心安神、补中益气之功能，是中医用药之一[1,2]，兰州百合、龙牙百合和岷江百合是野生百合经过多年驯化、品种筛选以及人工栽培后，获得可食用的百合品种，因其口味甜美幽香，被定义为一种营养价值较高的蔬菜[3]。

然而，在市场经济利益的驱动下，某些商家开始模糊食用百合和药用百合的界限，擅自赋于并夸大食用百合的药用功效，不仅混淆药用、食用百合品种[4]，还对百合干和百合粉等诸多加工形态的商品中进行互掺等违规操作，这也是中药材掺假中常见的违规现象[5,6,7]，很难通过外形、味道进行鉴别。因此，开发科学、可靠的鉴定方法，对这些主流食用百合种质进行标识，符合现代食品安全策略[7,8,9]。

EST-SSR分子标记技术是利用聚合酶链式反应（PCR）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和凝胶成像设备呈现生物基因组中特定序列的一种技术，该技术结合生物信息学，分析特定基因序列出现的频率和差异，从而达到鉴别目的[10]。EST-SSR分子标记技术在物种鉴定中的应用已经非常成熟[11,12,13]，尤其在中药材的鉴定中已有较多报道[14,15]。该技术最大的优点为开发简单、快捷、成本低[16,17,18]。

然而，随着科学技术的快速发展，在中药材分子鉴定领域，出现DNA条形码等新的分子鉴定技术，加上已有的随机扩增多形性DNA(RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单重复序列区间（ISSR）、相关序列扩增多态性（SRAP）、ITS/ITS2[19,20],EST-SSR分子标记技术在众多分子标记技术中，受哪些影响因素制约，适宜于哪些中药材进行鉴定标记的开发，是一个重要的科学问题。

本研究以美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI）对百合EST序列的更新公布为契机，对卷丹及在我国具有地理性标志且在市场上热销的5种百合进行EST-SSR分子标记实验，以期寻找可以鉴别这些百合种质的鉴定引物及相应的分子标识体系。同时，通过本次开发案例，探讨类似百合遗传基础的物种，EST-SSR分子标记技术对其开发的效率和鉴定的能力，为该技术在中药材鉴别中的应用提供参考案例。

1、材料与仪器

1.1 材料

参试百合样品分为种质资源样本和待检测百合商品，其中种质资源样本由甘肃省农业科学院百合资源圃提供，由甘肃省人民医院主任医师马得茸进行鉴定，分别为兰州百合Liliumdavidiivar.willmottiaeBlanca、香水百合L.casaBlanca、卷丹L.lancifoliumThunb、龙牙百合L.brownievar.viridulum、岷江百合L.regaleWilson，其种质的真实性由中国农业科学院蔬菜研究所给予保障，具体来源信息见表1。本次分子标记体系的构建，每处来源分2次，每次随机选取3个样本，进行个体取样。待检测百合商品通过实地和网购获得，共计收集19批次，分为34份，每份样本数量不同，进行混合取样，人为混掺品由种质资源样本，按质量比进行混掺，见表2。

表1种质资源样品信息

表2待检测的百合商品信息

1.2 试剂与仪器

TIANGEN植物基因组提取试剂盒（离心柱型）、Goodview核酸染料、DNAMarker(DL500bp,DL2000bp），天根生化科技有限公司；TaqPCRMasterMix瑞泰（北京）生物科技有限公司；琼脂糖、50×TAEElectrophoresisbuffer、50×TBEElectrophoresisbuffer生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯甲烷，广州瑞真生物科技有限公司；PAGE-Pre-Solution(40%,19∶1）北京索莱宝科技有限公司，所有化学试剂均为分析纯。

V600型琼脂糖凝胶电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；DYY-12型核酸电泳仪，北京六一生物科技有限公司；Bio-RadT100PCR仪、GelDocXR+凝胶成像系统，伯乐生化仪器公司；HITACHIRXII多用途冷冻离心机，株式会社日立制作所；HWS24型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司。

2、方法

2.1 样本DNA的提取

采用试剂盒提取法。标准品样本取1g左右鳞片，加入适量液氮研磨成粉，商品样本中鲜品按个体取鳞片混合，称取1g加入适量液氮研磨成粉，商品样本中的百合干混合破碎，称取1g加入适量液氮研磨成粉，百合粉直接进行称量，将适量的粉状的组织装于1.5mL的离心管中，按照DNA提取试剂盒提供的试剂及步骤进行基因组提取，最终获得的基因组用ddH2O溶解，置于-25℃环境中进行保存。

2.2 EST-SSR引物的设计及获取

通过NCBI官方网站，获得百合属LiliumL.EST序列共3902条，将EST序列信息保存为Fasta格式文件，利用Perl计算机语言中的Est＿timmer.pl程序，去除EST序列中过短的序列（<100bp）和过长的序列（>700bp）和mRNA的“帽子”和“尾巴”，利用CD＿HIT程序去除冗余序列，利用Misa.pl程序识别定位SSR位点，通过Primer3程序模块，批量生成EST-SSR引物信息，发送引物信息至生工生物工程（上海）股份有限公司，合成所需引物。

2.3 PCR扩增体系与凝胶电泳体系

2.3.1 梯度PCR反应体系（20μL)

2×TaqPCRMasterMix为10μL，上下游引物各1.6μL,DNA模版1.0μL，去离子水6.0μL。梯度PCR反应程序：95℃、5min,94℃、45s，退火（Tm值±5℃）、30s,72℃、1min,35次循环，72℃、10min。

2.3.2 琼脂糖凝胶电泳体系

用1×TAE电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶。将10μL的PCR扩增产物，在凝胶板上的孔中点样，用DNAMarkerDL2000bp做相对分子质量标记，电压（90～110V），电泳时间30min。丙烯酰胺凝胶电泳体系：用1×TBE配制8%的PAGE凝胶，PCR扩增产物点样8μL，以DNAMarkerDL500做相对分子质量标记，电压（180～220V），电泳时间为60～90min。电泳结果用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。

2.4 百合EST-SSR分子鉴定体系的构建与验证

以香水百合和兰州百合（种质资源样本）做相互对照，通过梯度PCR和琼脂糖凝胶电泳依次筛选EST-SSR引物，以对照基因组PCR扩增产物共有退火温度（Tm）值，且相互间具有显著差异泳带为特征，获得初筛引物。利用丙烯酰胺凝胶电泳体系，对初筛获得的引物再次筛选验证，以同一品种共有的特异性泳带和不同品种间共有的差异性泳带为特征，获得可鉴别所有百合样本的鉴定引物，标识不同品种的鉴别位点，构建百合的EST-SSR分子鉴定体系。利用构建的百合EST-SSR分子鉴定体系对收集的百合商品样本和人为混掺样本进行检测，验证百合EST-SSR分子鉴定体系的实用性和有效性。

3、结果与分析

3.1 不同百合商品分子标记试验的可靠性验证

本实验的商品百合有百合鲜品、百合干和百合粉，琼脂糖电泳结果显示，植物基因组提取试剂盒对百合鲜品和百合干的基因组提取质量较好，而百合粉提取的基因组泳带模糊，有基因组降解的现象（图1-A）。丙烯酰胺凝胶电泳结果进一步显示，百合鲜品、干状物和粉状物提取基因组的PCR扩增产物泳带清晰，相互间存在一致泳带（图1-B），该结果表明，利用植物基因组提取试剂盒提取百合鲜品、百合干和百合粉的基因组，可以参与后期相关分子标记的研究，虽然百合粉提取的基因组质量较差，但不影响其分子标记结果。

图1不同百合产品进行分子标记试验的可靠性验证

A-基因组质量的检测B-基因组PCR产物的检测M-Marker1～2-鲜百合3～4-百合干5～6-百合粉

3.2 SSR鉴定引物的初筛及其PCR扩增产物的分析

对NCBI公布的百合属EST序列进行SSR引物设计，获得199对设计引物，利用琼脂糖电泳筛选26对SSR引物。26对SSR引物对参试的对照样本可进行有效的PCR扩增（图2），该结果表明，利用Perl计算机语言批量设计EST-SSR引物的方法有效，可以作为SSR引物设计的方法之一。其次，通过对电泳图谱的进一步分析，26对SSR引物的PCR扩增产物有5种结果：（1）对照间具有“梯度PCR”的特征，对照间带型差异较小（图2-A);(2）对照间具有“梯度PCR”的特征，对照间带型一致（图2-B);(3）参试样本之一没有PCR扩增产物（图2-D);(4）参试样本之一没有表现“梯度PCR”的特征（图2-E);(5）对照间具有“梯度PCR”的特征，对照间带型具有显著差异（图2-C），扩增出5种带型图谱所用SSR引物的比例依次为8∶14∶1∶1∶2，基于本实验以筛选高效鉴定引物为目的，舍弃图2-A、图2-B、图2-D和图2-E带型对应的SSR引物，以扩增出图2-C泳带特征的引物作为初筛鉴定引物。

图2梯度PCR初筛SSR引物的琼脂糖电泳结果

1～8-香水百合9～16-兰州百合

3.3 初筛鉴定引物的验证筛选与百合EST-SSR分子鉴定体系的构建

丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，初筛获得的2对SSR鉴定引物对参试样本均能进行PCR扩增，其中引物JZ396的PCR产物具有特征为同一品种具有共同的特征泳带，不同百合品种间具有共同的差异特征泳带，虽然泳带清晰，但较为杂乱，尤其可鉴别种质的特征泳带相互比较，间距较短，显示较弱，容易发生鉴别失误，该引物不适宜做参试百合品种的鉴别引物。引物JZ391的PCR产物具有特征为同一品种有共同的特征泳带，不同百合品种间也具有共同的差异特征泳带，泳带清晰，特征泳带明显，不同品种辨别容易，经过多次重复验证，其PCR产物稳定，鉴定结果可靠，为此，引物JZ391被选为本次百合分子鉴别体系构建的鉴别引物（图3）。同时，该结果间接证明了本研究中采用的引物筛选方法是有效的。

百合EST-SSR分子鉴定体系构建如下：引物JZ391（正向：TAAGTATGTCCAGCCCGGAG，反向：GTGGGTCCCTTCAGGGTTT);Tm值57.5℃；基准鉴别位点为兰州百合98bp，卷丹360bp，岷江百合270、185bp，龙牙百合505、325bp（图3）。

图3初筛SSR引物对百合种质资源的PAGE电泳结果

M-MarkerA-兰州百合B-岷江百合C-香水百合D-卷丹E-龙牙百合

3.4 百合EST-SSR分子鉴别体系对商品百合的检测结果

应用构建的百合EST-SSR分子鉴别体系对收集的商品百合样本和人为混掺样本进行检测，结果显示，34份商品百合样本中，91%的样本符合商家对百合种质的描述，有3份商品样本中，发现混掺现象，15号样本检测出卷丹和龙牙百合，21号样本检测出卷丹和兰州百合，22号样本检测出卷丹和香水百合，发现种质混掺的百合产品为百合干和百合粉，且有2份样本属于保健品，本研究中的鲜品百合没有发现种质混掺现象，该结果表明，本研究构建的百合EST-SSR分子鉴定体系可对混掺的商品百合进行种质辨别，可对不同性状的百合产品进行有效鉴别。同时，人为设置的混掺样本35号和36号，检测出龙牙百合和兰州百合品种，其中36号样本，混掺的兰州百合为龙牙百合的万分之一质量，其特征泳带几乎没有发生衰减。该结果表明，本研究构建的百合EST-SSR分子鉴定体系可鉴别痕量痕迹（图4）。

4、讨论

4.1 卷丹及我国主要食用百合品种的鉴别方法及其EST-SSR分子标记建立的意义

卷丹、兰州百合、龙牙百合和岷江百合的鲜品，其外形差异较为明显（图5），因此，参试百合的鲜品可通过外形直接进行鉴别。百合干和百合粉是市场常见的百合商品，由于鳞片脱水和机械破碎，该性状的百合商品很难通过外形进行种质鉴别，可勉强通过口味进行鉴别，如卷丹微苦、兰州百合微甜、龙牙百合偏糯等[21]。通过外形和口味进行鉴别的方法，直观简单，适宜大众在日常生活中使用，而应对大宗百合商品的鉴别，由于存在商业风险，传统的鉴别方法已经不能胜任，需要采用科学、可靠的鉴别方法。

然而，目前报道的鉴别方法是针对不同鉴别需求而设计的，如药用百合可通过薄层色谱法检测百合内含物进行鉴别[1]；兰州百合可通过果胶或多糖含量进行鉴别[22]，这些鉴别方法不能对参试的百合品种进行绝对的种质鉴别，且这些方法在技术上存在共同的缺点：很难鉴别混掺样本。鉴于上述现状，本研究获得的鉴别体系，可对参试的百合种质进行特异性分子标识，得益于分子标记的技术特点，在药品质量控制层面，该体系可辅助百合药品质量检测，确定基原种质，在药品、食品安全层面，该体系可辨识真伪、混掺的商品百合，这对保护地理标识品牌，维护百合市场安全和秩序具有一定的现实意义。

图4EST-SSR分子鉴定体系对商品百合样本的检测结果

M-Marker1～34-商品百合样本35～36-人工混掺样本

图5不同百合品种的遗传表观特征

A-兰州百合B-岷江百合C-香水百合D-卷丹E-龙牙百合

4.2 物种的遗传基础对其EST-SSR分子标记开发能效的影响

利用最少的引物鉴定多数量物种是分子鉴定追求的目标[23]，然而，在目前的研究报道中，EST-SSR分子标记技术的鉴定能力均不相同，如厚毅清等[24]利用开发的6对SSR引物，鉴别了近缘属间的的黄芪与红芪；赵雅楠等[25]利用15对引物组合，对43份绿豆品种进行种间鉴别；蒋超等[26]利用开发的3对引物，对忍冬属下的4个种进行种间鉴别。分子标记技术的本质是在DNA水平上寻找保守基因序列和差异基因序列，多数科属间的物种有天然的生殖屏障，不能进行基因交流，非常容易发现这些基因序列，但到了种间鉴别，由于授粉等各种基因交流方式，使得种间的基因差异变的很小，较难开发出高效的分子鉴别体系。这也是不同物种鉴别标记开发效率和鉴别能力各不相同的根本原因[27]，而在本实验中，采用的研究对象存在极端的遗传基础：第一百合物种具有自交不亲和性，通过鳞茎进行无性繁殖[28]；第二，参试的百合品种为我国地理标识农产品，在特定的区域有近百年的栽培历史[29,30,31]，这些极端的遗传基础造成参试百合品种的遗传表观特征（花色、鳞茎）具有显著的差异性（图5），其显著程度近似于不同科属间的物种。基于该特征，本次EST-SSR鉴定标记的开发效率和鉴定能力均有不俗的表现，该结果证实了研究对象的遗传基础是影响其EST-SSR分子标记技术开发能效的重要因素，这对如何选择研究对象，有效发挥并应用该技术，具有一定的指导意义。

4.3 EST-SSR分子标记技术在中药材鉴别中开发方向的探讨

中药材中存在许多需要达到种间鉴别的物种，如川芎LigusticumchuanxiongHort.与伪品茶芎LigusticumsinenseOliv.cv.Chaxiong，半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit与伪品掌叶半夏PinelliapedatisectaSchott，浙贝母FritillariathunbergiiMiq.与混淆品伊贝母FritillariawalujewiiRegel，及伪品皖贝母FritillariaanhuiensisS.C.ChenetS.P.Yin等[1,32]，这些中药材及其伪品、混淆品具有相同的科属分类，且通过茎节、球茎等方式进行无性繁殖，其遗传背景也与百合的遗传背景非常相似，为此，鉴于本次鉴定标记的开发结果，如利用EST-SSR分子标记技术优先对这些中药材进行鉴定标记开发，应具有获得高效分子鉴定体系的潜力。

4.4 百合EST-SSR分子鉴别体系的优缺点

本实验开发获得的鉴别体系，所需设备为分子实验室的基础设备，具有鉴别成本低和应用范围广的的优点。兰州百合，卷丹和龙牙百合的鉴别位点在图谱中呈现显著，可直接应用，岷江百合的鉴别位点与卷丹部分样本的SSR位点距离较近，因此，在实际应用中，如用毛细管电泳法分检测该位点[33]，应具有更好的辨识效果（图4）。此外，该体系可鉴别至少万分之一质量的混掺样本，其应对大宗百合商品的鉴别，具有痕量鉴别的优势。

研究获得了药用百合品种卷丹，食用百合品种兰州百合、岷江百合和龙牙百合的EST-SSR分子标识体系，该标识体系可有效鉴别种质互掺的商品百合，具有一定的实用价值。此外，通过本研究案例，探讨并证实了物种的遗传基础是影响其EST-SSR分子标记开发的重要因素，提出了应用该技术对通过无性繁殖，且具有地理标志的道地中药材，优先进行鉴定标记开发的参考建议。

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基金:甘肃省农业科学院创新团队项目(2016GAAS59-02,2019GAAS-CGZH03,2019GAAS05);甘肃省农业科学院中青年基金项目(2017GAAS92,2017GAAS94).