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透骨血竭散对大鼠类风湿性关节炎炎症因子的影响研究

2024-07-18 15 上传者：管理员

摘要：目的：探讨透骨血竭散对类风湿性关节炎（RA）大鼠炎症因子的影响及作用机制。方法：选取无特定病原体（SPF）雄性SD大鼠60只作为研究对象，按随机数字表法将其分成5组，即正常组、模型组、对照组、外敷组和内服组，每组各12只。正常组不予任何干预，其余4组均采用Ⅱ型胶原诱导型关节炎造模法制备成RA模型，造模成功并分组后第2天开始给药。模型组给予等量生理盐水，每日1次；对照组给予扶他林软膏外敷；外敷组将透骨血竭散研磨成粉末，用清水调成膏状，适量涂抹在SD大鼠病变部位的皮肤上；内服组将透骨血竭散水煎取汁，用药管经口内服。给药5周后，比较各组大鼠体质量、足趾容积变化、关节炎评分、TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达，根据各组大鼠炎症因子表达情况分析其对RA的作用机制。结果：（1）内服组SD大鼠的足趾容积显著低于透骨血竭散外敷组（P<0.05）;（2）造模后21 d时模型组、对照组、外敷组和内服组的TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达均显著升高（P<0.05）,35 d时，对照组、外敷组和内服组的TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达均显著下降（P<0.05）。结论：透骨血竭散内服能更好地抑制RA大鼠TNF-α、IL-1β、TGF-β1炎性因子表达，减轻机体炎性反应，保护SD大鼠机体免受类风湿因子及其他病毒的破坏，减轻关节肿胀，改善关节功能，其机制可能与TLR4/NF-kB信号通路活化有关。

关键词：
RA
实验研究
炎症因子
类风湿性关节炎
透骨血竭散
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类风湿性关节炎(RA)病程发展缓慢，病因复杂，且致残率较高，是一种带有显著炎性特征且可累及周身关节的慢性代谢性疾病，西医认为RA与遗传、免疫、环境等[1]因素有关，但病机尚未明了。RA多属本虚标实证，风、寒、湿、热是外部因素，正气不足，诸虚存内[2]才是发病的关键。据统计，RA发病不受年龄限制，女性发病居多，国内发病率为0.3 %～0.5 %[3]。细胞分子学和免疫学技术研究证实，各种参与炎症反应的细胞因子，在外界因素的刺激下会产生免疫应答，分泌大量的炎症因子，如TNF-α、IL-1β、TGF-β1等[4],在RA进展中起着举足轻重的作用，将其传递给朗格汉斯细胞(LCs)激活更高级的免疫细胞，如巨噬、淋巴、肥大等细胞组织[5],杀伤致病菌。同时若机体自身调节能力失衡，这些免疫细胞可能进一步释放炎症因子，引发更大的炎症反应。血竭散在《博济方》《疡科选粹》等典籍中均有记载，在《云岐子保命集》《校注妇人良方》中称作夺命散、夺命丹。肖智等[6]临床研究表明，该方用于治疗杖疮、夹伤，败血冲心，胸满上喘，语言颠倒，健忘失志等均有显著疗效。马拥军通过多年的临床实践并结合现代药理学研究证实，透骨血竭散在RA治疗方面收效良好，但多以外敷的方式给药，目前尚无内服的临床案例的报道。本研究通过动物实验探析透骨血竭散不同给药方式对RA炎性因子表达的影响及其作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验材料

SPF级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)大鼠60只，6～8周龄，体质量300～350 g, 平均(330.25±25.64)g, 购自重庆医科大学动物中心，饲养环境：常规饲养，自由进食，室温22～24 ℃,相对湿度50 %～70 %,实验前适应性喂养1周。实验过程中对60只SD大鼠的处理严格按照动物实验伦理要求进行，符合《关于善待实验动物的指导性意见》中的饲育、应用、运输及相关措施和《中国动物保护法制建设白皮书》相关规定。比较不同组别下SD大鼠初次免疫后1～5周时的体质量、双后肢足趾容积，关节炎症评分及TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂与仪器

①试剂：TNF-α、IL-1β、TGF-β1 ELISA试剂盒(购自武汉艾美捷科科技有限公司),DAB显色剂、VEGF、ApoA-1一抗、枸橼酸盐缓冲液、抗体稀释液(均购自博士德公司),PV-9000二抗(购自中杉金桥公司),Ⅱ型胶原(购自美国Chondrex公司)。②仪器：酶标仪(型号DNM-9606)、分光光度计(型号721)、台式低速离心机(型号Cenlee 4K)、超低温冷动储存箱(型号DW-HI528S)、组织脱水机(型号JT-12J)、石蜡包埋机(型号JB-L6)、生物组织摊烤片机(型号JK-6)、超纯水机(型号ZWL-PAI-20),分别购自北京普朗新技术、上海菁华科技、湘立科学仪器、中科美菱低温科技股份、武汉俊杰电子、武汉俊杰电子、武汉俊杰电子、中沃水务环保科技，显微镜购自日本尼康公司等。

1.2.2 实验药物

①扶他林软膏(批号：H 10980297)的用法用量：外用，按痛处面积大小确定使用剂量，揉搓使其渗入SD大鼠皮肤。②透骨血竭散的方药组成：透骨草、补骨脂、艾叶、当归、桂枝、忍冬藤各10 g, 青风藤9 g, 土鳖虫、白芥子、白芍、红花、血竭各6 g。将其分成2份，1份研磨成粉末，用清水调成膏状待用；1份加适量清水煎煮，取适量药汁待用。大鼠口服剂量为0.8 g/kg。

1.2.3 动物分组与模型制备

将60只SD大鼠按随机数字表法分成5组，即正常组、模型组、对照组、外敷组和内服组各12只。正常组不予任何干预，其余4组SD大鼠均采用Ⅱ型胶原诱导型关节炎造模法制备成RA模型。操作方法：在事先备好的0.02 mol/L乙酸中滴加适量Ⅱ型胶原，放置在4 ℃环境下过夜，使其溶合混匀，再制作成乳剂(与等量弗氏佐剂11混合，在冰浴条件下充分乳化),取乳化后的混合物注射，每只0.1 mL。在SD大鼠的尾根皮下组织，注射后第7天，以相同剂量、相同部位再次免疫[7]。根据大鼠模型关节炎指数(AI)评分判定是否造模成功，造模成功标准：SD大鼠后肢后趾红肿，踝关节体积明显增大。AI评分≥6分[包括爪和趾(指)在内的整个爪评分之和，具体评分参照文献[8]]为造模成功。评估时间：初次免疫后第21天。将造模成功后的SD大鼠随机分成模型组、对照组、外敷组和内服组各12只。造模成功并分组后第2天开始给药。正常组模型组予以等量生理盐水干预，每日1次，连续5周，对照组予以扶他林软膏外敷，具体用法用量参1.2.2;外敷组用清水将透骨血竭散粉末调成膏状，取适量涂抹在SD大鼠病变部位的皮肤上；内服组取透骨血竭散适量药汁，用药管经口给药。对照组、外敷组和内服组每天给药1次，持续5周。给药期间，所有SD大鼠均自由饮水与摄食，每天称重1次。最后1次给药后对所有SD大鼠进行禁食不禁水干预，24 h后处死。

1.3 观察指标

比较5组SD大鼠体质量、足趾容积变化、关节炎评分、炎症因子(TNF-α、IL-1β、TGF-β1)表达。

1.4 效果评定

①体质量：从第2次免疫成功(给药干预第0天)开始，每隔1周对5组SD大鼠进行1次体质量检测，记录相应数据。②足趾肿胀度检测：从第2次免疫成功(给药干预第0天)开始，每隔1周运用水溶剂法测量1次SD大鼠的右后足容积，记录相应数据。③关节炎指数检测：从第2次免疫成功(给药干预第0天)开始，每隔1周用5级评分法评估SD大鼠关节炎指数，最高16分(所有关节炎指数之和),参照文献[9]拟定。关节炎症评分：初次免疫成功后第2、3、4、5周进行关节炎症评分[10],0分为无关节炎症，1分为单个爪或趾(指)红肿，2分为两个关节红肿，3分为3个及以上关节红肿，4分为全部关节红肿。关节炎症评分为趾(指)相加之和，最高16分，最低0分。AI(关节炎指数)≥6分为造模成功。④炎症因子：采用酶标法(ELISA)检测，每周取5组SD大鼠的踝关节滑膜组织匀浆及腹主动脉全血适量进行离心处理(离心温度4 ℃,离心速率4000 r/min, 离心时间10 min, 离心半径8 cm),并提取上清液及血清后按照ELISA试剂盒操作说明检测。

1.5 统计学方法

建立Excel数据库，将各基线资料、研究数据纳入SPSS 21.0软件处理，计数资料用χ2检验，计量资料用t检验，两个及两个以上样本均数差异的显著性检验用变异数分析(F检验),以均数±标准差

表示。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、研究结果

2.1 5组SD大鼠体质量比较

5组SD大鼠经治0、7、14、21、28、35 d体质量比较，差异无统计学意义(F=0.13、0.23、0.26、0.19、0.21、0.15,P>0.05)。造模组(模型组、对照组、外敷组、内服组)较治疗前均升高(P<0.05)。详见表1。

表1 5组SD大鼠体质量比较

2.2 5组SD大鼠足趾容积变化比较

造模第21天模型组SD大鼠足趾容积较对照组、外敷组和内服组显著升高(t=6.147、7.687、8.147,P=0.000、0.000、0.000),而透骨血竭散治疗第21天，内服组SD大鼠的足趾肿胀程度显著低于外敷组(t=5.147,P=0.001)。详见表2。

表2 5组SD大鼠不同时期足趾容积变化比较 mL,

相较于正常组，模型组滑膜组织中有大量炎性细胞浸润和血管生成，滑膜衬里层增厚极其明显，透骨血竭散内服后炎性细胞和血管不明显。详见图1。

图1 5组SD大鼠滑膜组织的病理改变

2.3 5组SD大鼠不同时期的关节炎评分比较

与正常组相比，造模后第21天模型组的关节炎症评分显著升高，足趾肿胀明显(t=8.654,P=0.000)。予以透骨血竭散治疗第14天，较之模型组，外敷组和内服组的关节炎症评分显著降低(t=7.914、8.914,P=0.000、0.000),内服组治疗第14天的关节炎症评分略低于外敷组，但差异不显著(P>0.05)。详见表3。

表3 5组SD大鼠不同时期的关节炎评分比较分，

2.4 5组SD大鼠治疗第21、35天炎性因子水平比较

与正常组比较，造模第21天，模型组、对照组、外敷组和内服组的TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达均显著升高(P<0.05);第35天，对照组、外敷组和内服组的TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达均显著下降(P<0.05)。详见表4。

表4 5组SD大鼠治疗第21、35天炎性因子水平比较 ng/mL,

3、讨论

RA作为一种自身免疫系统疾病，致残率较高，严重影响患者的生活质量。大量研究证明，RA在发病过程中伴有大量的炎症因子释放，常累及关节外器官，伴血清类风湿因子升高[11],可致手、足、膝、髋等关节畸形及功能丧失。其治疗方法包括健康宣教、早期治疗、联合用药、个性化治疗方案及功能锻炼。近十年来，关节外病变的治疗与新疗法的不断问世，RA预后有了明显改善，随着慢性抗风湿药物的联合应用(尤其是早期),大多数RA患者病情得到很好控制、减轻甚至是治愈[12]。研究发现，某些炎性指标对RA病情有预估和指导用药作用，可根据RA发病第一年的临床特点来大致判断预后。

透骨血竭散是在血竭散的基础上演变而来，由透骨草、补骨脂、艾叶、当归、桂枝、忍冬藤、青风藤、土鳖虫、白芍、红花、血竭及白芥子十二味中药组成。目前将其用于RA治疗的用药方式多以外敷为主，从检索文献来看，几乎没有以内服法治疗RA的案例。本研究结果显示，透骨血竭散能显著改善SD大鼠模型的RA症状，有效抑制TNF-α、IL-1β、TGF-β1等炎性因子过表达。李梅等[13]证实，模型组的胸腺指数和脾脏指数与正常组相比显著升高，说明Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及其介导的核因子-kB(Nuclear factor-kB,NF-kB)信号通路参与了RA患者的炎性反应，介导炎性因子表达，提示RA大鼠免疫系统被激活，局部抗原发生改变，炎症因子在滑膜组织中大量释放，从而导致滑膜炎症的发生，模型组大鼠胸腺指数和脾脏指数均比正常对照组有明显上升。透骨血竭散中的透骨草、青风藤、红花、当归、艾叶、血竭有舒筋活骨、祛风活血之效，IL-1β常与TNF-α同时合成分泌，共同破坏关节软骨而引起关节损伤，透骨血竭散能有效改善因IL-1β、TNF-α过表达所损伤的关节软骨组织。肖智等[6]发现，透骨血竭散可通过改善载脂蛋白E(ApoE)形态而抑制TNF-α、IL-1β等促炎因子的表达，同时透骨血竭散可抑制RA患者血管内皮生长因子(VEGF)生成。在RA进程中起主要作用的炎性介质是IL-1β、IL-6和TNF-α,它们刺激软骨细胞和滑膜细胞分泌胶原酶等破坏软骨细胞周围环境的物质，透骨血竭散中的桂枝、白芥子、白芍、松节可温经通阳、散寒止痛，能调节大鼠血清和踝关节等组织中的IL-1β、IL-6和TNF-α过表达。补骨脂、土鳖虫、血竭补肾壮阳、舒筋接骨，可促进RA患者局部血液循环[14]。透骨血竭散治疗1～3周后内服组的足趾肿胀程度显著低于外敷组(P<0.05),治疗第7、14天的关节炎症评分略低于外敷组，差异无统计学意义(P>0.05),提示透骨血竭散内服对TNF-α、IL-1β、TGF-β1炎性因子的抑制作用更明显，其内服主要依靠肠道消化(吸收、分布、代谢、排泄等)参与病变部位作用，可通过血液循环将透骨血竭散的有效成分输送至不同的病变组织，更快地抑制炎性因子表达，改善SD大鼠的关节功能。外敷主要依靠皮肤、黏膜细胞渗透吸收，能有效降低透骨血竭散对SD大鼠胃肠道刺激，避免破坏消化酶，可减轻肝脏和肾脏负担。两者差异可能与药理作用部位和起效速度有关。

综上所述，透骨血竭散内服能更好地抑制RA大鼠的TNF-α、IL-1β、TGF-β1等炎性因子表达，减轻机体炎性反应，保护SD大鼠机体免受类风湿因子及其他病毒的破坏，改善关节功能，其机制可能与TLR4/NF-kB信号通路活化有关。但本研究也存在两点不足，一是研究样本量偏低，二是缺乏创伤修复模型的发生、发展机制与疗效机理研究，未来研究可弥补其不足。

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文章来源:卢健,马拥军,陈彦军.透骨血竭散对大鼠类风湿性关节炎炎症因子的影响研究[J].国医论坛,2024,39(04):45-49.