复发性口腔溃疡（recurrent aphthous ulcer,RAU），在中医学中被称为“口疮”或“口糜”，是一类常见的口腔黏膜溃疡性疾病。经典名方清胃散是中医临床治疗口疮的常用方剂，在临床实践中具有较好的疗效[1,2,3]。黄连、升麻分别是清胃散的君药和臣药，是临床治疗胃火炽盛型口疮的常用药对。本文基于网络药理学与分子对接方法，筛选黄连-升麻药对的有效成分，并设计动物试验进行验证，以探讨其治疗RAU的潜在中西医机制，为RAU的治疗提供一种新的思路。

1、资料和方法

1.1网络药理学研究

1.1.1黄连-升麻药对活性成分筛选及作用靶点的筛选

使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)[4]检索黄连、升麻两味中药的化学成分，并以口服生物利用度（oral bioavability,OB）≥30%和类药性（drug-likeness,DL）≥0.18为标准，筛选出两味中药的活性成分，并查询相关文献进行补充[5,6]。然后在TCMSP中查询其对应靶点，并使用蛋白质序列数据库（Unified Protein Database,UniProt)将得到的靶点信息标准化为相应的基因名，利用Cytoscape 3.7.2软件构建黄连-升麻药对的活性成分-靶点网络。

1.1.2疾病相关靶点的筛选

利用在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM）数据库、人类基因组注释数据库（Human Genome Annotation Database,GeneCards)、疾病基因网络（Disease Gene Network,DisGeNet）数据库检索RAU的相关靶点，利用DrugBank数据库[7]检索RAU相关药物的作用靶点作为补充，对搜集到的靶点信息进行整合与去重处理，并使用UniProt数据库进行标准化处理，构建RAU的疾病靶点信息库。

1.1.3疾病-药物交集靶点的筛选

将黄连-升麻药对的活性成分对应的靶点信息与疾病靶点信息上传至在线Venny 2.1.0平台，进行交集分析并绘制韦恩图。

1.1.4交集靶点网络的构建与核心靶点的筛选

将疾病与药物的交集靶点的基因名称导入STRING平台[8]进行蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）分析，构建黄连-升麻药对作用于RAU的PPI网络，将PPI网络导入Cytoscape 3.7.2软件，利用CytoNCA插件进行拓扑分析[9]，以连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closeness）为依据，筛选出核心靶点。

1.1.5富集分析

使用Metascape网站对核心靶点进行基因本体（gene ontology,GO）富集分析与京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路富集分析[10]，设置P<0.01，筛选黄连-升麻药对治疗RAU的主要分子生物过程及信号通路，并绘制柱状图或气泡图对信息进行可视化处理。绘制“黄连-升麻”药对活性成分-RAU靶点-通路网络图，同时依据Degree值筛选出核心有效成分[11]。

1.1.6分子对接验证

从TCMSP及Zinc数据库下载核心药物活性成分结构的mol2格式文件，借助UniProt和蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）平台下载核心靶点的pdb格式结构文件。使用AutoDock程序对两类文件进行相关处理后进行分子对接，记录其结合能，以PyMOL软件将对接结果进行可视化。

1.2实证研究

1.2.1药物制备

黄连-升麻按照1:1的比例置于圆底烧瓶中，并加入清水浸泡30 min。采用文火进行煎煮，煎煮完成后进行回流提取，将滤液浓缩至0.44 g·mL-1，剂量参考临床服药剂量，并依据大鼠与人类体质量之比确定，按照相应比例加入0.9%氯化钠溶液，进行最终药液配置。

1.2.2模型构建及分组

无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级SD大鼠40只，体质量约220 g，购于广西医科大学实验动物中心[实验动物生产许可证号码：SCXK（桂）2020-0003]，饲养于北京中医药大学东方医院实验中心[实验动物使用许可证号码：SYXK（京）2019-0013]。将大鼠随机分为5组，每组8只，空白对照组不进行建模，其余4组均进行建模处理，空白对照组大鼠以0.9%氯化钠溶液灌胃，模型组建模后以0.9%氯化钠溶液灌胃，黄连-升麻低剂量组建模后以5%黄连-升麻药液灌胃，中剂量组建模后以10%黄连-升麻药液灌胃，高剂量组建模后以15%黄连-升麻药液灌胃，大鼠灌胃药物的浓度及剂量参考大鼠体质量确定。

1.2.3RAU模型构建

大鼠脊柱两侧注射完全弗氏佐剂构建RAU大鼠模型，每7 d注射一次，每次0.1 mL，一共注射3次。最后一次注射后大鼠出现口腔溃疡，则代表建模成功[12]。

1.2.4指标检测

1.2.4.1溃疡数目

各组大鼠均连续治疗7 d，治疗完成后统计各组大鼠的溃疡数目。

1.2.4.2靶点基因mRNA表达检测

采用实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR）检测各组大鼠口腔组织中关键靶点基因mRNA表达。末次给药后次日，采用脊柱脱臼法处死大鼠，采集大鼠口腔组织，选用Trizol试剂盒提取组织中的总RNA，逆转录合成cDNA，依据试剂盒说明书进行操作。反应条件：95℃5 min,95℃15 s,60℃32 s，共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作为内参，计算丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine kinase 1,AKT1）、白细胞介素-6(interleukin-6,IL6）、JUN原癌基因（JUN proto-oncogene,JUN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL1B）、胱天蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,CASP3）的mRNA相对表达量。

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用最小显著差异（least significant difference,LSD)-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1黄连-升麻药对药物成分及靶点基因

从TCMSP中检索黄连与升麻的药物有效成分并进行筛选后，得到黄连活性成分11个，升麻活性成分8个。见表1。筛选出黄连-升麻药对靶点蛋白191个，并使用UniProt数据库，将靶点蛋白标准化为基因名。利用Cytoscape 3.7.2软件构建黄连-升麻药对的活性成分-靶点网络。见图1。

2.2RAU相关靶点检索与交集靶点检索

在OMIM、Gene Cards、DisGeNet数据库中以“recurrent aphthous ulcer”“recurrent oral ulcer”“oral ulcer”为关键词检索RAU的相关靶点，分别得到相关靶点93、1 558和4个，另外于DrugBank数据库检索RAU相关药物的作用靶点15个，整合与去重处理后共得到1 635个疾病相关靶点，上传至Venny 2.1平台后测得药物靶点与疾病靶点的交集127个。见图2。PPI 127

2.3PPI网络构建与核心靶点筛选

将个交集基因导入到STRING平台进行PPI分析，并使用Cytoscape 3.7.2绘制PPI网络图，其中图标的颜色深浅与Degree值呈正相关。见图3。通过CytoNCA插件对其进行拓扑学分析，以下列4项指标的中位数Degree=34、Eigenvector=0.07、Closeness=0.57、Betweennes=30.79为阈值进行筛选，所得结果的PPI网络继续按照先前四项属性的中位数为阈值进行二阶段筛选，最终得到核心靶点23个。见表2。AKT1在交集基因PPI网络中的Degree值最高，为99.0，预测AKT1可能为“黄连-升麻”药对治疗RAU的最关键靶点，IL6、TNF、TP53、IL1B、CASP3、JUN亦为相对关键的靶点。

2.4交集基因GO与KEGG通路富集分析

将筛选出的23个核心靶点导入Metascape网站，分别进行GO富集分析，包括分子功能（molecular functions,MF）、生物过程（biological processes,BP）与细胞成分（cellular components,CC）分析，并使用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn）绘制条形图。其中涉及的BP主要有平滑肌细胞增殖的调节、细胞对化学应激的反应、细胞对脂多糖的反应等。见图4。KEGG信号通路富集分析提示，涉及的通路主要有癌症相关的通路、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）信号通路等。见图5。  

表1 黄连-升麻药对的活性成分  

图1 黄连-升麻药对的活性成分-靶点网络   

图2 药物靶点与疾病靶点分布图  

图3 交集靶点的PPI网络图    

表2 PPI网络中的核心靶点  

图4 GO富集分析条形图   

图5 KEGG通路富集分析气泡图   

2.5网络拓扑图构建

采用Cytoscape 3.7.2软件绘制“黄连-升麻”药对活性成分-RAU靶点-通路网络，根据Degree值的排序筛选出的核心有效成分为槲皮素（quercetin）、维斯阿米醇（visamminol）、豆甾醇（stigmasterol）、巴马亭（palmatine）。见图6。

图6 黄连-升麻药对活性成分-RAU靶点-通路网络  

2.6分子对接验证

将筛选得到的核心成分槲皮素、维斯阿米醇、豆甾醇、巴马亭与Degree值最高的核心靶点AKT1、IL6、JUN、TNF、IL1B、CASP3、TP53进行分子对接。见表3。分子对接结果显示，豆甾醇与各靶点蛋白均有较好的结合力，其中结合力最强的为豆甾醇与AKT1以及TNF，说明其可能为主要成分及靶点。见图7。  

表3 分子对接分数  

图7 分子对接结果   

2.7各组大鼠核心靶点的mRNA表达水平与溃疡数量

与空白对照组比较，模型组，黄连-升麻低、中、高剂量组AKT1、IL6、JUN、TNF、IL1B、CASP3的mRNA表达与溃疡数量明显升高（P<0.05）。与模型组比较，黄连-升麻低、中、高剂量组核心靶点mRNA的表达与溃疡数量均明显降低（P<0.05），而且剂量越大，作用越强（P<0.05）。见表4。  

表4 各组核心靶点的mRNA表达水平 

3、讨论

RAU发病机制复杂，中医学认为，口疮病因涉及内外两个方面，外因主要为外感风热、火毒、湿浊等，内因通常与体质、饮食、劳逸、情志等因素有关，这些因素导致人体脏腑功能失调而发病。口疮的病理性质分为虚实两端，实者多为热邪熏灼口舌，灼伤肌膜；虚者多因气血阴阳不足，虚火内生，口舌肌膜失却濡养而溃破难愈。RAU中医证型可分为心脾积热、胃火炽盛、阴虚火旺、脾虚阴火、寒热错杂等五种。从证型分布来看，病理因素多与火相关，因此中医治法以清热泻火、滋阴降火、补益脾胃为主。此外，也有医家采用化瘀通络、祛风散邪、敛疮生肌疗法治疗RAU，也取得了较好疗效。

从网络药理学分析结果可知，AKT1、IL6、TNF、IL1B、CASP3、JUN等可能是药对治疗RAU的核心基因靶点。AKT1可参与调节代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等多种过程。IL6的产物IL-6在免疫调节、炎症反应等方面起着重要作用，IL-6的快速产生有助于感染和组织损伤期间的宿主防御，但其过度合成与自身免疫疾病有关[13]。TNF的产物TNF-α可影响细胞的增殖分化与凋亡、凝血等多种反应，其具有趋化作用，可增强单核细胞及中性粒细胞的吞噬功能，并促使其释放多种趋化因子，导致口腔黏膜组织的损伤[14]。IL1B的产物IL-1β是强效促炎因子，可诱导前列腺素合成、免疫细胞流入和激活、细胞因子及抗体的产生、成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生、辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17）的分化等[15]。CASP3在细胞凋亡的执行阶段起着核心作用，也是坏死与炎症的重要信号通路[16]。JUN与细胞的增殖、分化、凋亡关系密切，可以上调炎症因子IL-1β相关基因的转录，在炎症中发挥重要作用[17]。分子对接结果显示，“升麻-黄连”药对的核心有效成分能与重要核心靶点蛋白产生自发且稳定的结合。KEGG通路分析结果显示，“黄连-升麻”药对治疗RAU的主要通路可能是IL-17信号通路与TNF信号通路等。IL-17信号传导对于黏膜的屏障防御和免疫功能的调节至关重要，Th17细胞通过IL-17调节上皮紧密连接蛋白的表达、抗菌肽产生的诱导和中性粒细胞化学引诱物的释放，发挥保护黏膜完整性和免疫监控的作用[18]。研究发现，IL-17刺激会促进巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-1β和TNF-α，进一步放大炎症反应[19]。TNF信号通路中的促炎细胞因子TNF-α参与了慢性炎症性疾病的发病机制，能够激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB）等信号通路，提高细胞在接受后续炎症刺激时的响应敏感性，这可能是急性炎症向慢性炎症转变的重要机制[20]。

“黄连-升麻”这一药对出自“金元四大家”之一李东垣所创的清胃散，是中医治疗口疮的经典名方。方中黄连为君药，苦寒泻火，可直折中焦胃腑之热；升麻为臣药，既取其清热解毒之效，又取其升散之功，宣散郁遏伏火，二者升降相因，泻火而无凉遏之弊，散火而无升焰之虞，有“火郁发之”之意。现代药理学研究发现，黄连的主要成分为生物碱、木脂素等，具有抗菌、抗炎、降血糖、抗氧化等多种药理功能[6,21]。升麻的主要成分为三萜及其苷类、酚酸类等[5,22]，具有抗感染、抗病毒、调节胃肠动力等作用[23]。临床上，胃火炽盛型RAU表现为溃疡周围充血红赤、灼热疼痛、齿龈红肿出血等，“火毒”表现明显，而“升麻-黄连”药对的清热泻火解毒功效，可能是通过IL6、IL1B、TNF等基因靶点以及IL-17与TNF等信号通路来调控TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎症因子发挥作用。研究表明，湿热证患者血清中免疫因子水平显著高于正常人[24]，推测黄连的清热燥湿作用可能与通过IL-6与IL-17信号通路进行免疫监控调节相关。此外，该药对具有调控细胞增殖、分化与凋亡，以及促进黏膜完整性的作用，故口疮溃疡面的愈合也可能与中医治法“敛疮生肌”的功效相关。GO分析显示该药对参与平滑肌细胞增殖的调节和上皮细胞迁移的调节等生物作用过程，也印证了这一观点，这或是中医治法综合疗效的又一有趣体现。动物实验发现，“升麻-黄连”药可减少大鼠口腔溃疡数目，提示“升麻-黄连”可有效缓解大鼠口腔溃疡病情。进一步研究发现，口腔溃疡大鼠采用“升麻-黄连”药进行干预可有效抑制AKT1、IL6、JUN、TNF、IL1B、CASP3的表达，提示“升麻-黄连”药可能通过调控上述核心靶基因的表达从而缓解口腔溃疡病情。

综上所述，本研究借助数据库在生物信息学层面对“黄连-升麻”药对治疗RAU的潜在机制进行预测，研究结果体现了中医治法的多靶点、多通路的综合整体治疗特点，也为后续“黄连-升麻”药对的潜在机制研究提供了新的方向，研究团队将在此基础上进行相关实验研究，以进一步明确“黄连-升麻”药对的主要调控靶点。

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基金资助:国家自然科学基金面上项目(81874386);北京中医药大学东方医院“1166”人才项目(040204001001002024)~~;

文章来源:姜皓曦,董君莹,王珂等.基于网络药理学的黄连-升麻药对治疗复发性口腔溃疡中西医学机制探讨[J].浙江中医药大学学报,2024,48(02):154-163+169.