糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，其主要原因是胰岛素分泌障碍或胰岛素耐受性降低，糖尿病将导致内脏器官受损，并引发一系列并发症，甚至威胁生命[1,2]。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的主要微血管并发症之一，患病人数约占糖尿病患者的30%～40%[3,4]。DN已经成为全球终末期肾病的主要原因，并且也是糖尿病患者死亡的主要因素之一[5]。在发达国家，约40%的DN患者最终面临透析[6],DN带来了显著的社会经济和公共卫生负担，因此寻找预防和治疗DN的有效方法至关重要。

DN发病机制复杂，与糖脂代谢紊乱、炎症反应、氧化应激等因素有关，其特异性标志为蛋白尿[7]。目前治疗DN的主要方法是降血糖、降血压等常规治疗。然而这些治疗方法存在局限性，相比之下，中药在临床应用中显示出较好的疗效，因此研究中药对DN的保护机制成为一种新的研究方向[8]。

参芪地黄汤出自清代名医沈金鳌撰写的《杂病源流犀烛》一书，由六味地黄丸化裁而成，去泽泻加用人参、黄芪，滋补肾精同时大补元气以培本固元，有助于化生气血而无伤阴之弊。方中“三补”即熟地黄、山药和山茱萸，着重补养肾、脾及肝三脏，兼顾涩精益髓之功；配伍牡丹皮清泄相火，制约山茱萸之温涩；茯苓淡渗脾湿，以助山药之健运，共奏益气养阴、补益脾肾之效，补中有泄，泄中寓补，补而不滞，动静结合，达气阴双补之功，适合守方缓图[9]。研究显示，参芪地黄汤滋肾健脾、养阴益气，用于DN治疗能提升效果，改善肾功能[10]。本研究通过体内实验探讨参芪地黄汤对DN小鼠的治疗作用以及对铁死亡的影响，揭示参芪地黄汤治疗DN的作用机制。

1、材料和方法

1.1 动物

无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级雄性C57BL小鼠60只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008]，体质量（20±2) g，饲养于嘉兴学院动物实验中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2020-0007]。饲养环境相对湿度50%～70%，温度23～26℃，自然昼夜节律。本研究中动物实验经嘉兴市中医医院批准（批准文号：SL-2022-0015）。

1.2 药品与试剂

参芪地黄汤由党参6 g、黄芪15 g、熟地黄15 g、茯苓9 g、丹皮9 g、山茱萸9 g、山药15 g、生姜3片、大枣2枚组成，药物均购于嘉兴市中医医院；铁死亡抑制剂3-氨基-4-环己基氨基苯甲酸乙酯（Ferrostatin-1,Fer-1）购于美国MedChemExpress公司（批号：HY-100579）；链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）均购于北京索莱宝科技有限公司（批号：S8050、PC0020）；尿蛋白、尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（cre⁃atinine,Cr）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）、4-羟基壬烯醛（4-hy⁃droxynonenal,4-HNE）、总Fe、还原型谷胱甘肽（re⁃duced glutathione,GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所（批号：C035-2-1、C013-2-1、C011-2-1、A003-1-2、E004-1-1、H268-1-2、A039-2-1、A006-2-1、A061-1-2）；前列腺6跨膜上皮抗原3(sixtransmembrane epithelial antigen of prostate 3,Steap3）抗体购于北京博奥森生物有限公司（批号：bs-12825R）；谷胱甘肽合成酶（glutathione synthe⁃tase,GSS）抗体、转铁蛋白（transferin）抗体、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7member 11,SLC7A11）抗体、溶质载体家族3成员2(solute car⁃rier family 3member 2,SLC3A2）抗体、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4）抗体、谷氨酸-半胱氨酸连接酶（glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体均购于proteintech公司（批号：15712-1-AP、17435-1-A、26864-1-APP、A5702、67763-1-lg、12601-1-AP、20536-1-1AP）。

1.3 方法

1.3.1 DN模型制备

60只小鼠适应性喂养1周后，选取50只用于制备DN模型，给予高糖高脂饲料（10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、67.5%常规饲料）喂养8周，另外10只给予正常饲料喂养。第8周末，禁食不禁水12 h后，高糖高脂饲料喂养的50只小鼠腹腔注射STZ 120mg·kg-1（溶于0.1mol·L-1柠檬酸钠缓冲液，pH=4.5）；另外10只小鼠作为正常组，腹腔注射等体积的1%柠檬酸钠缓冲液。注射后72 h，尾静脉采血测定小鼠的随机血糖水平。以血糖≥16.7mmol·L-1为2型糖尿病模型建立标准。小鼠继续喂养，每周检测24h尿蛋白含量。以血糖水平≥16.7 mmol·L-1、尿糖阳性、尿蛋白阳性，作为DN模型建立标准。

1.3.2 分组及给药

根据随机数表法，将造模后的小鼠分为模型组、Fer-1组（予10 mg·kg-1 Fer-1）和参芪地黄汤低、中、高剂量组（分别予5.4、10.7、21.3 g·kg-1参芪地黄汤），每组10只。各给药组给予相应药物灌胃，正常组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续4周，每周测定1次血糖。

1.3.3 生化指标检测

参芪地黄汤干预4周后，使用代谢笼收集24 h尿液，4 000 r·min-1离心10 min，按照试剂盒说明书检测24h尿蛋白定量。目内眦取血，3 000 r·min-1离心15 min，收集血清，按照试剂盒说明书检测血清Cr、BUN水平。

1.3.4 氧化应激相关指标检测

取部分冻存的小鼠肾组织，用预冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffered sa⁃line,PBS）漂洗3次，称取0.1 g组织加入900μL0.9%氯化钠溶液低温匀浆，3 000 r·min-1离心15 min后，收集上清液，根据试剂盒说明检测MDA、ROS、4-HNE、总Fe、GSH、GSSG水平。

1.3.5 肾组织病理学染色

干预4周后，小鼠新鲜肾组织以4%多聚甲醛固定，固定不少于48 h后梯度乙醇脱水，制备石蜡切片，分别进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色及过碘酸-雪夫（peri⁃odic acid-Schiff,PAS）染色，光镜下观察组织病理学改变。

1.3.6 免疫印迹法检测相关蛋白水平

采用免疫印迹法检测肾组织中铁死亡相关蛋白transferin、Steap3水平以及GPX4通路相关蛋白SLC7A11、SLC3A2、GPX4、GCLC、GSS水平。取20mg冻存的小鼠肾组织，裂解匀浆后收集总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。电泳分离蛋白并转膜，在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h。之后，加入一抗transferin（稀释比例1:5 000）、Steap3（稀释比例1:1 000）、SLC7A11（稀释比例1:2 000）、SLC3A2（稀释比例1:2000）、GPX4（稀释比例1:4 000）、GCLC（稀释比例1:2 000）、GSS（稀释比例1:1 000）、β-actin（稀释比例1:10 000),4℃孵育过夜。洗膜后加入相应二抗（稀释比例1:20 000），室温下孵育2 h，洗膜后化学发光法显影，扫描电泳条带图像，以β-actin为内参照。应用ImageJ软件量化后，计算目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时，采用最小显著差异法（least significant difference,LSD）检验；方差不齐时，采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠体质量、血糖、肾功能指标比较

给药结束后，与正常组比较，模型组体质量明显下降（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组、参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠体质量显著增加（P<0.01）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤中、高剂量组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

与正常组比较，模型组空腹血糖显著升高（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组、参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠空腹血糖显著降低（P<0.01）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低剂量组小鼠空腹血糖差异无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组小鼠空腹血糖明显降低（P<0.05,P<0.01）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤中剂量组小鼠空腹血糖差异无统计学意义（P>0.05），高剂量组小鼠空腹血糖明显降低（P<0.05）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组小鼠空腹血糖明显降低（P<0.05）。见图1。

与正常组比较，模型组小鼠血清中Cr、BUN水平以及24 h尿蛋白定量显著升高（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组及参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠血清Cr(P<0.05,P<0.01）、BUN(P<0.01）水平及24 h尿蛋白定量降低（P<0.01）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低剂量组小鼠Cr、BUN水平及24 h尿蛋白定量均显著升高（P<0.01），参芪地黄汤中剂量组小鼠Cr、BUN水平以及24 h尿蛋白定量均显著升高（P<0.05,P<0.01），参芪地黄汤高剂量组小鼠Cr与24 h尿蛋白定量差异无统计学意义（P>0.05),BUN明显升高（P<0.05）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤中剂量组小鼠Cr、BUN水平差异无统计学意义（P>0.05),24 h尿蛋白定量显著降低（P<0.01）；参芪地黄汤高剂量组小鼠Cr水平差异无统计学意义（P>0.05),BUN水平与24h尿蛋白定量显著降低（P<0.01）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组小鼠Cr水平差异无统计学意义（P>0.05),BUN水平与24h尿蛋白定量显著降低（P<0.01）。见图1。

图1 各组小鼠体质量、血糖、肾功能指标比较  

2.2 各组小鼠病理学变化

HE染色显示，正常组小鼠肾组织结构正常，肾小管上皮细胞无明显变性，肾小球结构显示正常，系膜细胞无增生，未见明显炎性细胞浸润。与正常组比较，模型组小鼠肾组织结构明显异常，肾小管严重扩张，上皮细胞脱落和变形，部分上皮细胞呈现气球样变，胞质显示不完整，间质中少量炎症细胞浸润，肾小球呈肥大状态。与模型组比较，各给药组肾组织受损程度较轻，部分肾小管扩张，个别肾小管上皮细胞数量减少并呈气球样变，肾小球轻度肥大，未见炎性细胞浸润，其中Fer-1组与参芪地黄汤高剂量组病理改善最为明显。见图2。

PAS染色显示，正常组小鼠肾脏结构完整且清晰，基底膜光滑，肾小球形态规则，肾小管排列整齐，无炎性细胞浸润；模型组肾小球毛细血管基膜增厚，囊腔狭窄，系膜细胞和基质明显增生硬化。与模型组比较，各给药组肾小球结构受损程度均有不同程度改善，无囊腔狭窄，其中Fer-1组与参芪地黄汤高剂量组肾小球病理改善最为明显。见图2。

图2 各组小鼠肾组织病理学变化（100×）   

2.3 各组小鼠肾组织脂质过氧化指标比较

与正常组比较，模型组小鼠肾组织中MDA、ROS及4-HNE水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组及参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠肾组织中MDA、ROS及4-HNE水平降低（P<0.01）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低、中剂量组小鼠肾组织中MDA、ROS及4-HNE水平均显著升高（P<0.01）；参芪地黄汤高剂量组小鼠ROS以及4-HNE水平差异无统计学意义（P>0.05),MDA水平明显升高（P<0.01）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤中剂量组小鼠MDA与4-HNE水平差异无统计学意义（P>0.05),ROS水平显著降低（P<0.01）；参芪地黄汤高剂量组小鼠MDA、ROS以及4-HNE水平显著降低（P<0.01,P<0.05）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组小鼠MDA、ROS以及4-HNE水平显著降低（P<0.01,P<0.05）。见图3。

图3 各组小鼠肾组织脂质过氧化指标比较  

2.4 各组小鼠肾组织铁死亡比较

与正常组比较，模型组小鼠肾组织Fe水平明显升高（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组及参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠肾组织中Fe水平均明显降低（P<0.01,P<0.05）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠肾组织中Fe水平均明显升高（P<0.01）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤中剂量组小鼠肾组织Fe水平差异无统计学意义（P>0.05）；参芪地黄汤高剂量组小鼠肾组织Fe水平显著降低（P<0.01）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组小鼠肾组织Fe水平显著降低（P<0.01）。见图4。

与正常组比较，模型组transferin、Steap3水平升高（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组transferin、Steap3水平显著降低（P<0.01）；参芪地黄汤低剂量组transferin水平显著降低（P<0.05),Steap3水平差异无统计学意义（P>0.05）；参芪地黄汤中、高剂量组trans⁃ferin、Steap3的水平明显降低（P<0.05）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低剂量组transferin、Steap3水平明显升高（P<0.05）；参芪地黄汤中、高剂量组transferin、Steap3水平差异无统计学意义（P>0.05）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤中剂量组transferin、Steap3水平差异无统计学意义（P>0.05）；参芪地黄汤高剂量组transferin水平差异无统计学意义（P>0.05),Steap3水平明显降低（P<0.05）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组transferin、Steap3水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

图4 各组小鼠肾组织铁死亡比较   

2.5 各组小鼠肾组织GPX4通路蛋白表达比较

与正常组比较，模型组小鼠肾组织GSH/GSSG显著降低（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组及参芪地黄汤低、中、高剂量组小鼠肾组织GSH/GSSG水平明显升高（P<0.01）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低、中剂量组GSH/GSSG水平明显降低（P<0.01,P<0.05）；参芪地黄汤高剂量组GSH/GSSG水平差异无统计学意义（P>0.05）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤中、高剂量组GSH/GSSG水平差异无统计学意义（P>0.05）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组GSH/GSSG水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

与正常组比较，模型组SLC7A11、SLC3A2、GPX4、GCLC、GSS表达降低（P<0.01）。与模型组比较，Fer-1组与参芪地黄汤低、中、高剂量组SLC7A11(P<0.01,P<0.05）、SLC3A2、GPX4、GCLC、GSS表达明显升高（P<0.01,P<0.05）。与Fer-1组比较，参芪地黄汤低剂量组SLC7A11表达降低（P<0.01),SLC3A2、GCLC、GSS表达降低（P<0.05),GPX4表达差异无统计学意义（P>0.05）；参芪地黄汤中、高剂量组SLC7A11、SLC3A2、GPX4、GCLC、GCLC表达差异无统计学意义（P>0.05）。与参芪地黄汤低剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组GPX4表达升高（P<0.05），参芪地黄汤中、高剂量组其他蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。与参芪地黄汤中剂量组比较，参芪地黄汤高剂量组SLC7A11、SLC3A2、GPX4、GCLC、GCLC表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

图5 各组小鼠肾组织GPX4信号通路蛋白表达比较  

3、讨论

本研究通过高糖高脂饮食联合STZ注射建立了DN小鼠模型，并给予参芪地黄汤干预。结果显示，参芪地黄汤可以显著降低24 h尿蛋白、血糖、Cr、BUN等生化指标，提示参芪地黄汤对DN小鼠具有较好的治疗作用。

氧化应激是指在多种病理状态下，机体内产生的自由基和ROS数量超过了抗氧化系统的清除能力导致的氧化损伤。当ROS与多不饱和脂肪酸发生反应时，会发生脂质过氧化，导致脂质过氧化物的形成，进而造成细胞损伤[11]。研究证明，高血糖引起的ROS增多是DN发展的关键因素之一[12,13]。MDA是脂质过氧化的终产物，可以反映组织细胞内ROS水平和氧化损伤程度，因此MDA通常被用作评估氧化应激和细胞损伤的关键指标之一[14]。4-HNE与氧化应激具有密切关系，它也是脂质过氧化的产物之一，可以通过与蛋白质、核酸和磷脂等分子发生共价结合，从而导致细胞内氧化应激损伤[15]。本研究结果显示，DN模型小鼠MDA、ROS、4-HNE水平升高，存在明显的脂质过氧化物累积，而参芪地黄汤干预可以降低MDA、ROS、4-HNE水平，这为参芪地黄汤治疗DN的机制探索提供了方向。

铁死亡是一种由erastin和RSL3引发的全新细胞死亡方式，具有铁依赖性和氧化性特征[16]。在这一细胞死亡过程中，铁的过量积累和脂质过氧化起着关键的作用。在细胞内，过量的铁离子会与氧化应激反应产生的过氧化物相互作用，引发自由基产生和脂质过氧化的级联反应。当细胞无法通过抗氧化机制有效清除过量的过氧化物时，过氧化脂质的积累就会触发铁死亡过程[17]。transferin和Steap3参与铁离子的转运和代谢[18]，与铁离子的累积密切相关。Fer-1有助于维持细胞内抗氧化系统的正常功能，可以有效地减少过量铁离子引起脂质过氧化[19]，因此本研究选用Fer-1作为阳性对照。在本研究中，DN模型小鼠总Fe水平以及transferin、Steap3蛋白表达显著升高，而Fer-1和参芪地黄汤干预可以使总Fe水平以及transferin、Steap3蛋白表达不同程度降低。

GPX4信号通路作为铁死亡过程中的关键调节通路，参与了糖尿病的发生发展，主要因为GPX4是抑制脂质过氧化的关键抗氧化酶，可以抑制铁死亡的发生[20,21,22]。GSH和GSSG是细胞内重要的氧化还原对，GSH通过与GPX4相互作用，可以将ROS和其他氧化物质还原为无害的化合物，同时GSH被氧化为GSSG。因此高GSH/GSSG比例表示细胞处于还原状态，有助于维护细胞的抗氧化能力和正常代谢[23]。本研究结果表明，参芪地黄汤干预可以升高DN模型小鼠中的GSH/GSSG比例。半胱氨酸是GSH合成的关键底物。在正常情况下，细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸转运体将半胱氨酸从胞外转运至胞质，为细胞内GSH的合成提供了必要的半胱氨酸供应[24]。SLC7A11和SLC3A2是胱氨酸/谷氨酸转运体的亚基，在细胞膜上共同调节半胱氨酸的摄取[25]。在GPX4通路中，GSH是GPX4所需的底物，通过将膜磷脂氢过氧化物还原为脂醇，减少ROS的生成。而GSH的合成依赖于GCLC和GSS的协同作用。GCLC通过催化半胱氨酸和谷氨酸的反应合成GSH，而GSS则参与调节GSH的合成速率[26]。研究表明，DN中存在细胞亚铁和脂质过氧化物的积累，线粒体功能障碍，以及抗氧化系统GPX4和GSH的减少[27]。本研究结果显示，DN模型小鼠SLC7A11、SLC3A2、GPX4、GCLC、GSS蛋白表达水平明显降低，Fer-1和参芪地黄汤干预可以使SLC7A11、SLC3A2、GPX4、GCLC、GSS蛋白表达水平有所升高，提示参芪地黄汤可以促进调节GPX4信号通路。

综上所述，本研究结果证实参芪地黄汤对DN小鼠具有治疗作用，其作用机制可能与通过调控GPX4信号通路抑制铁死亡有关。

参考文献:

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基金资助:浙江省中医药科技计划项目(2023ZR134)~~;

文章来源:王向晶,周奕菁,黄科,等.参芪地黄汤通过GPX4信号通路调控糖尿病肾病小鼠铁死亡的机制研究[J].浙江中医药大学学报,2024,48(04):407-415.