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孕期砷暴露在大鼠胎盘屏障的转运及对胎盘的影响

2025-03-20 95 上传者：管理员

摘要：目的探讨胎盘对砷的屏障作用，以及砷对胎盘的影响。方法选取7周龄大鼠随机分为对照组、低、中、高剂量组，雌鼠受孕后实验组开始给予砷暴露。持续暴露20 d后，取母体血、胎鼠血通过双通道原子荧光光谱仪检测血中的砷浓度，采用HE染色做病理切片观察胎盘的病理改变，采用免疫组化观察胎盘中的胰岛素样生长因子1(Insulin-Like Growth Factor, IGF1)和胎盘生长因子(Placental Growth Factor, PLGF)阳性表达情况。结果砷暴露期间发生大鼠死亡及流产现象；各组大鼠染毒后体重随怀孕天数逐渐增加，但差异无统计学意义(P>0.05);母体与胎鼠血中砷浓度随着各剂量组增加而增加，各剂量组的胎盘对砷的透过率随着染砷浓度的增加而升高(P<0.05);与对照组相比，高剂量组胎盘质量有所下降(P<0.05),胎鼠体重随着染砷剂量增加而降低，高剂量组体重下降(P<0.05);与对照组相比，随着染砷浓度的增加胎盘海绵滋养层模糊，血窦及母体血管减少。与对照组相比，低剂量组IGF1阳性表达增高(P<0.05),中、高剂量组PLGF阳性表达增高(P<0.05)。结论随着砷处理浓度的增加，母体血中砷浓度逐渐增加，胎盘对砷的屏障作用逐渐减弱，进入到胎儿血中，导致胎盘和胎儿质量下降，胎盘中PLGF表达水平出现异常，胎盘发生病理性改变。

关键词：
地壳元素
有毒类金属
胎盘
胎盘生长因子
胎盘透过率
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砷属于有毒类金属,是自然界普遍存在的地壳元素,现已广泛用于半导体､合金制造和饲料添加剂等多种行业[1]｡一般人群主要通过饮水､饮食和吸入受污染的空气等途径发生砷暴露,并且砷在人体内具有蓄积性[2]｡长期暴露于砷会导致皮肤病变､呼吸系统疾病､心血管疾病和癌症[3]｡此外,砷暴露还可增加早产､低出生体重､胎儿丢失及死产等多种不良妊娠结局的风险[2,4-5]｡胎盘在胎儿的生长发育起着运输营养物质及代谢废物尿酸､尿素,进行气体交换等功能,另外,胎盘还有屏障功能,可以阻止很多对胚胎或胎儿有害的物质通过胎盘危及胎儿的生长和发育｡胡虹等[6]以每个产妇母血砷/脐血砷>1来衡量胎盘屏障功能,发现健康孕妇胎盘屏障功能较好,降低了胎儿接触砷的风险｡然而,日本的一项流行病学研究[7]表明,脐带血中的砷是母体血中的2倍,表明胎盘不具有对砷的屏障作用｡边沁[8]通过流行病学调查发现,胎盘可能对Ni和As无有效的屏障作用｡血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是内皮细胞的特异性生长因子,可增加滋养层细胞的增殖和侵袭能力,在调节滋养层细胞侵入方面发挥重要作用｡W.M.Catherine等[9]的研究表明,砷通过降低血管内皮生长因子受体的表达,导致胎盘血管生成缓慢､数量减少,进而导致胚胎不能正常发育｡M.Rahman等[10]的研究表明,砷可以通过影响microRNA的表达从而影响胎儿的生长｡X.Li等[11]的研究表明,在暴露于亚砷酸盐的胚胎中Dvr1的表达明显下调,通过吗啉代反义敲低Dvr1的胚胎显示异常发展,包括心包水肿和失败的循环,这类似于砷处理的缺陷表型｡李勇[12]的研究结果表明,砷可能会直接影响胚胎发育｡目前对于胎盘对砷是否有屏障作用尚未定论,砷的胚胎毒性机制尚未阐明,有研究认为砷直接对胚胎具有毒性作用,而也有研究[13]认为砷的胚胎毒性是通过影响胎盘结构功能而介导的｡本研究拟通过大鼠孕期染砷模拟人群孕期砷暴露,检测脐带血和母体血中砷浓度,以探究胎盘是否具有屏障作用;同时,称取胎盘重量并观察胎盘的结构､病理切片,以探究砷是否能通过影响胎盘的正常结构和功能,从而影响胎儿或胚胎的正常生长发育｡

1、材料和方法

1.1主要试剂和仪器NaAsO2购自北京化学试剂三厂;苏木精伊红染色试剂､免疫组化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;IGF1､PLGF抗体购自上海江莱生物有限公司;双通道原子荧光光度计购自赛默飞世尔科技有限公司;倒置荧光显微镜购置上海永科光学仪器有限公司｡

1.2实验动物分组68只7周龄雌性SD大鼠,体重为(219.65±10.55)g,20只7周龄雄性SD大鼠,体重为(271.59±9.35)g,由湖南斯莱克景达公司提供[动物质量合格证:SCXK(湘)2019-0004]｡适应性喂养1周后随机分为对照组(纯水)､低剂量组(1.4mg/kg)､中剂量组(7mg/kg)､高剂量组(14mg/kg)｡按照3:1进行雌雄合笼,通过阴道涂片确定大鼠是否受孕,受孕后经口给予砷持续暴露20d,对照组给予相同体积的纯水｡20d后将孕鼠麻醉,取母体血,胎盘,胎鼠,胎儿血,称量并记录胎盘和胎儿质量｡

1.3血砷浓度检测

1.3.1血样处理全血样品4℃冰箱解冻,解冻后漩涡混匀,取20μL样品至小烧杯中,加入1mLH2O2和1.5mLHNO3,密封后90℃水浴1h｡水浴后将样品置电热板上,130℃加热30min,期间要加少量HNO3防止溶液碳化,消解液为无色透明近干时为消化终点｡冷却后加入5%HCl溶解液､5%硫脲和5%还原型抗坏血酸溶液1mL,用5%HNO3定容至10mL,混匀,反应30min,待测｡

1.3.2工作参数原子荧光光度计工作参数见表1｡

表1原子荧光光度计工作参数项目仪器参数

1.3.3标准曲线的绘制将1000μg/mL的砷标吸取0､5､10､20､50､100､200､400､600μL至100mL容量瓶中,用5%HCL分别定容至10mL,摇匀,配制成浓度0､0.5､1､2､5､10､20､40､60μg/mL的标准溶液系列｡

1.3.4定量分析与检测血样中的砷通过预还原剂还原为三价砷(As3+),As3+与硼氢化钾反应生成气态氰化钾,进入原子化器中被原子化,以砷高强度空心阴极灯作为激发光原,砷原子受光辐射激发产生荧光,荧光光谱线的波长可以进行定性分析｡在一定条件下,荧光强度与被测物质浓度成正比,据此原理进行检测血砷浓度｡

1.4HE染色大鼠胎盘组织取出后,在4%甲醛溶液中浸没24h,进行组织脱水和石蜡包埋,切取4μm切片｡切片脱蜡后,使用苏木精染色10min,盐酸酒精5sec,1%氨酒精1min,脱水透明后使用中性树脂封片,然后使用病理扫描仪扫描并存储图像｡

1.5免疫组化大鼠胎盘组织切片脱蜡后,进行抗原修复,滴加一抗孵育过夜,酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物室温孵育20min,DAB显色液显色5min,苏木素染色液孵育30s,脱水透明后使用中性树脂封片,然后使用病理扫描仪扫描并存储图像｡每个胎盘选取3个视野,用ImageJ进行定量分析｡

1.6统计学方法各组大鼠怀孕后体重变化用重复测量方差分析,母体血和胎儿血砷浓度差异采用配对t检验,各剂量组胎盘质量､胎儿体重､PLGF､IGF1表达采用单因素方差分析,组间比较采用LSD(满足方差齐性)或DunnettT3(不满足方差齐性),以P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1砷暴露致大鼠死亡及流产情况共68只雌鼠,剔除孕前死亡､假孕､分娩､未孕大鼠,剩余48只大鼠怀孕,大鼠怀孕后经砷暴露,其中低剂量组大鼠流产1只,高剂量组大鼠流产3只;怀孕后死亡的低､中､高剂量组大鼠各1只｡大鼠的怀孕及死亡情况见图1｡

图1大鼠的怀孕及死亡情况

2.2受孕后砷暴露母鼠体重变化各组大鼠染毒后体重随孕期推移而逐渐增加,差异无统计学意义(P>0.05)｡见图2｡

图2大鼠怀孕后体重变化

2.3母体血和胎儿血砷浓度对照组母体血和胎鼠血砷浓度均未检出,染毒组母体血和胎鼠血均检出砷｡各剂量组母体血砷浓度不同,随着砷处理剂量的增加而升高(P<0.05)｡各剂量组胎鼠血砷浓度不同,随着砷处理剂量的增加而升高(P<0.05)｡在低剂量组中,胎儿血砷浓度(10.13±8.26)μg/L低于母体血(97.59±25.48)μg/L(P<0.05),砷的胎盘透过率为10.38%;中剂量组胎儿血砷浓度(95.23±12.17)μg/L低于母体血(203.05±26.89)μg/L(P<0.05),砷的胎盘透过率为46.90%;高剂量组胎鼠血砷浓度(162.95±22.88)μg/L低于母体血(198.91±8.06)μg/L(P<0.05),砷的胎盘透过率为81.92%｡见图3｡

图3各剂量组母体血和胎儿血砷浓度

2.4胎盘质量和胎儿体重校正总胎数和死胎数后,与对照组相比,低､中剂量组胎鼠体重无显著改变(P>0.05),高剂量组胎鼠体重显著下降(P<0.05),见图4A｡与对照组相比,低､中剂量组胎盘质量无显著改变(P>0.05),高剂量组胎盘质量显著下降(P<0.05),见图4B｡

图4各剂量组胎盘和胎儿质量

结构清晰,迷路层血窦大小正常,含血丰富;低剂量组和中剂量组海绵滋养层结构模糊,胎盘血窦变小;高剂量组海绵滋养层模糊,迷路区细胞分化异常,血窦及母体血管减少｡见图5

图5大鼠胎盘HE染色

组IGF1阳性表达显著增高(P<0.05),中､高剂量组阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),见图6A;与对照组相比,低剂量组PLGF阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),中､高剂量组阳性表达显著增高(P<0.05),见图6B｡

图6大鼠胎盘免疫组化

3、讨论

长期暴露于砷污染的环境中,会导致胎盘基因表达异常,从而改变胎儿胎盘多种生物学功能异常[14],同时也会诱发胎盘中的氧化应激反应和炎症反应,而脐带血中的促炎细胞因子会在体外诱导胎盘中的滋养层细胞凋亡[15],从而导致胎儿生长发育受限｡本研究结果表明,暴露于高剂量组胎儿体重显著下降｡这可能是胎鼠在母体内开始形成时就处于砷暴露环境中,导致砷在胎鼠体内蓄积量增多,对胎鼠生长发育的毒性效应变大,影响了胎鼠生长发育,表现为对胎鼠体重增长的抑制｡胎盘的发育是通过囊胚的滋养外胚层分化形成多个滋养层细胞谱系,每个系都有不同的生物学活性[16],可以从母体获取营养支持胎盘自身和胎儿的发育｡本研究结果显示,高剂量组的胎盘质量显著下降｡这可能是由于孕期暴露于砷环境中,会导致滋养层细胞凋亡,影响胎盘的生物学活性[17-18],从而影响胎盘的发育｡胎盘拥有强大的防御屏障,可以限制致病微生物进入母胎循环,致病微生物是无法进入到胎儿的血液循环系统,只有特定的物质才能被胎盘允许进入胎儿体内[19]｡本研究结果显示,随砷暴露的剂量升高,残留在胎鼠血中的砷也越多,砷的胎盘透过率越高,即砷剂量越高,胎盘对砷的屏障作用越弱｡可能是因为砷与体内金属硫蛋白能相互作用,金属硫蛋白与三价砷代谢物存在物质间的化学键结合[20],导致胎盘功能紊乱,从而增加砷在胎盘的透过率｡胎盘血管形成受到影响会进一步影响胎儿发育,导致胎儿生长受限等不良妊娠结局[21]｡我们发现砷暴露致大鼠胎盘血窦数量减少,面积缩小,表明砷可能影响大鼠胎盘血管形成｡砷可能导致胎盘组织中血管紧张素-2(AngiotensinⅡ,Ang-Ⅱ)水平减少,Ang-Ⅱ为典型的血管生成激活因子,Ang-Ⅱ减少会抑制滋养细胞分化增殖,导致胎盘血管发育被抑制,胎盘血氧缺乏[22]｡

胎盘生长因子(placentalgrowthfactor,PLGF)是一种促血管生成因子,通过与血管内皮生长因子受体1(vascularepidemalgrowthfactorreceptor-1,VEGFR-1)结合而增强VEGF的血管生成作用,PlGF的功能及结构与VEGF有高度同源性,也可以促进内皮细胞生长､胎盘血管生成和子宫血管舒张等作用[23]｡本研究发现砷暴露后导致PLGF表达水平显著增高,说明PLGF可能参与了胎盘的病理变化｡IGF1可促使血管内皮细胞释放凝酶原激活物,从而改善胎盘功能,刺激滋养细胞侵入､迁移以及舒张血管,参与血压调节｡在低剂量砷暴露后IGF1表达出现上调,而中高剂量IGF1表达未出现异常,这表明低剂量砷暴露可能导致胎盘功能异常,机体为了保护胎盘功能释放了更多IGF1因子,IGF1在砷暴露过程中具有提示和预测作用｡

本实验使用SD大鼠建立了孕期砷暴露模型,观察到高剂量砷显著降低胎鼠体重和胎盘质量;大鼠孕期暴露低剂量砷时,砷的胎盘透过率较低,胎盘对砷具有较好的屏障作用;砷浓度越高,砷的胎盘透过率越高,胎盘对砷的屏障作用越弱｡砷导致PLGF表达水平异常,抑制了大鼠胎盘血管形成｡可推测,砷对胎儿有直接的影响,通过影响胎盘,从而影响胎儿健康｡今后的研究可以探索砷是通过何种机制影响胎盘血管的,从而如何进一步影响胎儿;以及砷可能直接对胎儿造成的危害｡

参考文献:

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基金资助:遵市科合支撑[HZ(2020)200号];

文章来源:陈中宝,田应宽,邹春丽,等.孕期砷暴露在大鼠胎盘屏障的转运及对胎盘的影响[J].贵州医药,2025,49(03):348-352.