作为最常见的妇科恶性肿瘤之一，宫颈癌近年来发病率增加，而且发病年龄趋于年轻化[1-2]。随着宫颈癌早期筛查的普及，宫颈癌早期诊断率提升。国际妇产科联盟(FIGO)指南指出：ⅠA1～ⅡA1期(早期宫颈癌)均可采取手术治疗，手术效果良好，但早期宫颈癌伴淋巴结转移、宫旁浸润及切缘阳性需术后联合同步放化疗；ⅡB～ⅣA期及ⅠB3/ⅡA2期(局部晚期宫颈癌)在术前需采取同步放化疗，缩小肿瘤体积后再进行根治性切除；ⅣB期(晚期宫颈癌)及复发转移性宫颈癌主要采用化疗、免疫及靶向治疗等系统治疗[3]。中晚期宫颈癌及复发转移性宫颈癌的临床治疗较棘手，患者生存率无法得到有效改善，急需开发新的临床治疗靶点以改善中晚期宫颈癌及复发转移性宫颈癌患者预后[4-7]。SH2结构域结合蛋白1(SHCBP1)参与细胞内各种信号转导途径的调节。由异常EGFR信号通路激活诱导的SHCBP1核易位可提高β-连环蛋白的活性，从而促进肺癌进展；FGF13和SHCBP1之间的相互作用介导的Akt-GSK3 α/β信号激活，从而促进肿瘤细胞生长；SHCBP1也可导致Wnt通路激活，有助于肿瘤细胞抵抗细胞凋亡，引发肺癌治疗中的顺铂抵抗。由于HER2-SHCBP1-PLK1信号通路激活，胃癌组织中SHCBP1显著上调，胃癌患者对曲妥珠单抗治疗的临床反应较差，研究[8]发现SHCBP1与肿瘤的发生和发展密切相关，可以作为肿瘤预后标志物[9-13]。目前，关于SHCBP1在宫颈癌组织中表达水平的相关研究报道较少，而且关于SHCBP1在宫颈癌组织及癌旁组织中的差异表达的报道更少。为阐述SHCBP1调控宫颈癌进展的生物学作用，本研究首先分析了不同恶变程度的宫颈上皮脱落细胞中的SHCBP1表达差异，基于HPV感染结果分析SHCBP1基因表达水平与HPV感染的相关性，基于生物信息学分析SHCBP1基因在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达与意义，并基于细胞模型探索SHCBP1基因表达与宫颈癌细胞恶性生物学行为的相关性。

1、资料与方法

1.1 资料来源

收取2022年7月—2023年10月内蒙古自治区人民医院妇产科和内蒙古医科大学附属医院肿瘤内科患者的宫颈上皮脱落细胞，共343例，患者年龄21～72岁，平均(42.13±9.81)岁，同时分别收集30例宫颈癌组织及癌旁组织新鲜样本与30例宫颈癌组织及癌旁组织石蜡固定样本，所有纳入的患者在术前均未接受任何放射或化学药物治疗，在术前已经充分告知患者并签署了患者知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂

Trizol、RNA反转录试剂盒、Q-PCR试剂盒均购于大连Takara生物公司；氯仿、异丙醇及无水乙醇均购于广州化工集团有限公司；细胞相关试剂购于大连美菱生物有限公司。

1.2.2 引物序列

SHCBP1引物序列由NCBI设计后，交由上海生物工程有限公司合成，SHCBP1上游引物序列为：5'-GCTACCGTGATAAACCAGGTTC-3';下游引物序列为：5'- AGGCTCTGAATCGCTCATAGA-3'。

1.2.3 宫颈上皮脱落细胞收集

用专用的脱落细胞采集器收集患者宫颈上皮脱落细胞。在细胞收集过程中，首先利用窥阴器暴露患者的宫颈组织，用一次性消毒棉拭子快速擦去患者宫颈口分泌物，将宫颈刷放于宫颈口处旋转4～5周，取出后将宫颈刷头部充分浸泡于含细胞保存液的一次性洗脱管中，登记样本及患者信息后将洗脱管送至实验室。

1.2.4 脱落细胞的处理及保存

洗脱管到达实验室后，用冷冻离心机进行离心，取出沉淀后，用4 ℃预冷的PBS溶液洗涤2遍，向沉淀中缓慢加入1 ml的Trizol溶液后，将离心管放置于-80 ℃冰箱中保存，于1周内完成样本RNA的提取及逆转录合成实验。

1.2.5 分组

基于液基薄层细胞学检查(TCT)结果，将患者进行分组，其中58例宫颈癌，56例高度鳞状上皮内病变，108例低度鳞状上皮内病变，121例非典型鳞状细胞。HPV分组：根据HPV结果，将患者分为3组，其中143例HPV16阳性和(或)HPV18阳性、78例其他基因型HPV阳性及122例HPV阴性。

1.2.6 RT-PCR

利用Trizol法提取患者宫颈上皮脱落细胞RNA,反转录合成cDNA后进行Q-PCR扩增实验。

1.2.7 免疫组织化学染色

采用EnVision二步法进行石蜡切片的免疫组织化学检测，严格按照试剂盒说明书操作，枸橼酸盐缓冲液高温高压进行抗原修复，5% BSA溶液封闭，滴加兔抗SHCBP1多克隆抗体(稀释比1∶500),4 ℃孵育过夜后，行DAB显色，封片后光镜下观察，评估宫颈癌组织及癌旁组织中SHCBP1阳性着色及染色强度。

1.2.8 Western blot

利用RIPA裂解液分别进行宫颈癌组织及癌旁组织裂解、蛋白提取及BCA法蛋白定量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后进行脱脂牛奶封闭PVDF膜，封闭完成后，加入一抗兔抗SHCBP1多克隆抗体(稀释比1∶1 000)及内参兔抗GAPDH(稀释比1∶5 000),4 ℃下孵育过夜，TBST溶液漂洗PVDF膜3次后，按稀释比1∶2 000比例分别加入HRP 标记羊抗兔二抗，室温下孵育1 h后，用TBST溶液漂洗PVDF膜，加入ECL溶液成像后记录蛋白表达水平，并用Image J 软件行条带灰度值分析，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.2.9 细胞培养

宫颈癌SiHa细胞复苏后，用完全培养液(含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基)进行培养，培养条件为37 ℃、5% CO2。待细胞汇合度达到80%时，利用胰酶消化法进行传代。

1.2.10 慢病毒-转染及药物筛选

取生长状态良好的SiHa细胞，以每孔1×106个/孔的接种密度接种于12孔板中，待SiHa细胞生长汇合度达到50%时，缓慢滴加LV-SHCBP1-shRNA慢病毒(MOI=100),加入感染增强液后放于培养箱中培养，12 h后更换新鲜完全培养基，培养72 h, 在荧光显微镜下观察SiHa细胞中绿色荧光蛋白表达；加入嘌呤霉素进行药物筛选，药物筛选2周后构建敲除SHCBP1的SiHa细胞，即LV-SHCBP1-shRNA组，未转染慢病毒的SiHa细胞为对照组。完成药物筛选后，利用Q-PCR扩增实验及Western blot分析对比两组细胞中的SHCBP1基因、蛋白表达水平，验证基因敲除效率。

1.2.11 MTT检测细胞增殖能力

取对数生长期的LV-SHCBP1-shRNA组细胞及对照组细胞，按照1×105个/孔密度将细胞接种于96孔板中，37 ℃培养箱中培养24 h, 利用MTT法检测各组细胞增殖能力。

1.2.12 Transwell实验检测细胞侵袭能力

将Transwell小室上层加入Matrigel溶液，放于37 ℃培养箱中，孵育0.5 h; 取对数生长期的LV-SHCBP1-shRNA组细胞及对照组细胞，取200 μl细胞悬液(细胞密度为5×105个/ml)加入Transwell上室中，在Transwell下室加入500 μl完全细胞培养液，培养24 h。利用4%多聚甲醛溶液固定Transwell小室底膜20 min, 并用 0.1%结晶紫染液染色15 min, 流水冲洗后自然晾干，于显微镜下观察并记录Transwell小室细胞侵袭情况。

1.2.13 划痕实验检测细胞迁移能力

将对数生长期的LV-SHCBP1-shRNA组细胞及对照组细胞接种于6孔板中(接种密度为1×105个/孔),培养24 h后，使用无菌枪头划过6孔板，制备划痕，并观察记录；继续培养24 h后拍照、记录细胞迁移情况，利用Image J软件计算细胞迁移率。

1.2.14 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

取对数生长期的LV-SHCBP1-shRNA组细胞及对照组细胞，按照1 000个/孔密度将细胞接种于6孔板中连续培养，7 d后用4%多聚甲醛溶液固定6孔板，PBS漂洗后，用0.1%结晶紫溶液染色，显微镜下检查并记录两组细胞的克隆形成数目。

1.2.15 粘附实验检测细胞粘附能力

将30 μl纤连蛋白(5 μg/ml)加入96孔培养板中，37 ℃培养箱中过夜孵育后室温下空气干燥，加入30 μl 0.1%牛白蛋白溶液封闭后抽弃。取对数生长期的LV-SHCBP1-shRNA组细胞及对照组细胞，以每孔5×103个细胞的密度重新接种于纤连蛋白预包被的96孔培养板上。放于37 ℃培养箱中培养30 min后，用DPBS溶液轻轻洗涤96孔培养板以去除非粘附细胞。然后用甲醇溶液固定附着的细胞，用0.1%结晶紫溶液染色。用显微镜拍摄并记录各组粘附细胞的数量。

1.2.16 细胞周期检测

取对数生长期的LV-SHCBP1-shRNA组细胞及对照组细胞，接种于100 mm培养皿中，于37 ℃培养箱中培养24 h后收集细胞，加入预冷的75%乙醇溶液进行重悬，4 ℃固定24 h, 按照周期试剂盒说明书，加入RNA酶孵育20 min后加入PI试剂，避光反应30 min, 应用流式细胞仪检测细胞周期变化。

1.3 统计学分析

利用相对定量法(2△△Ct法)对PCR结果进行定量分析；利用GEPIA数据库、UALCAN数据库综合分析SHCBP1基因在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达差异；分析SHCBP1表达水平与宫颈癌细胞恶性生物学行为之间的相关性；使用SPSS 19.0软件分析数据，组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 宫颈上皮脱落细胞中SHCBP1表达与宫颈组织病变的相关性

非典型鳞状细胞、低度鳞状上皮内病变、高度鳞状上皮内病变、宫颈癌中SHCBP1表达水平分别为(3.75±1.49)、(4.10±1.56)、(7.41±1.51)、(11.52±2.13),差异有统计学意义(F=352.50,P<0.05)。宫颈上皮脱落细胞中SHCBP1相对表达水平随宫颈病变程度增加而增加，在宫颈癌患者中最高。

2.2 宫颈上皮脱落细胞SHCBP1表达水平与患者HPV感染的相关性

HPV16/18阳性组、HPV阴性组、其他基因型HPV组SHCBP1表达水平分别为(8.93±2.79)、(3.83±1.47)、(3.65±1.44),差异有统计学意义(F=248.70,P<0.05)。

2.3 生物信息学及临床表达水平分析

GEPIA数据库和UALCAN数据库结果表明：宫颈癌SHCBP1蛋白表达水平高于其对应的癌旁组织，与临床样本实验结果一致。见图1。

2.4 敲除SHCBP1表达与宫颈癌细胞恶性生物学行为的相关性分析

与对照组相比，慢病毒转染SHCBP1显著抑制了宫颈癌细胞中的SHCBP1蛋白[空白组(1.13±0.11)vs.敲除组(0.15±0.06)]和mRNA[空白组(1.00±0.00)vs.敲除组(0.32±0.09)]表达水平，证明了本研究采用的慢病毒转染技术的可行性。敲除SHCBP1不仅显著抑制了宫颈癌细胞的迁移率[空白组(100.00±0.00)%vs.敲除组(56.84±6.01)%]、克隆形成率[空白组(100.00±0.00)%vs.敲除组(57.72±6.11)%]及粘附率[空白组(100.00±0.00)%vs.敲除组(38.70±7.53)],而且有效提高了宫颈癌细胞的凋亡率[空白组(3.51±0.56)%vs.敲除组(18.00±2.11)%],表明SHCBP表达水平与宫颈癌细胞的恶性生物学行为密切相关。见图2。

图1生物信息数据库评估SHCBP1蛋白表达水平及宫颈癌组织中的SHCBP1蛋白表达

图2SHCBP1敲除对宫颈癌细胞恶性行为的影响

3、讨论

全世界每年诊断570 000例宫颈癌病例，其中310 000例患者死亡[14]。尽管宫颈癌筛查有助于降低发病率和死亡率，但目前宫颈癌筛查率普遍较低。传统的宫颈癌细胞筛查通常需要病理学家在显微镜下观察数千个细胞，并根据诊断标准提供报告，该方法耗时，劳动密集，严重依赖医生的经验且主观性很强[15]。为解决上述弊端，计算机辅助宫颈癌细胞检测在临床上得以应用，根据分析流程中是否包含分割步骤，宫颈癌细胞的识别方法分为基于分割的识别方法和基于对象检测的识别方法，基于分割的识别方法通常对细胞或细胞成分进行分割，然后提取细胞特征进行细胞分类，这种方法的检测精度通常取决于细胞分割的结果，难以准确识别胞质边界模糊的重叠细胞，临床应用面临更多困难。与此同时，由于细胞质边界模糊的细胞重叠，传统计算机辅助检测算法的检测精度通常较低。由于宫颈癌细胞图像和自然图像之间的差异，一些典型的基于深度学习的检测方法，例如ResNets和Inception-V3,对宫颈图像并不总是有效的，导致这些基于网络系统开发的宫颈筛查很难直接应用于宫颈癌筛查的临床实践[15]。

通过自行收集阴道上皮脱落细胞进行基因检测已被提议作为不愿进行宫颈筛查的女性的额外策略，可以有效克服目前常规方法存在的弊端，在这些自行收集的标本中，HPV和宫颈高级别鳞状上皮内病变的检出率与医院采集后进行的标本筛查结果基本一致，进一步推动了宫颈上皮脱落细胞收集后基因检测的临床应用[16]。

本研究结果显示：宫颈上皮脱落细胞中的SHCBP1表达水平与宫颈病变程度、HPV感染水平密切相关，结合GEPIA数据库及UALCAN数据库分析结果，本研究结果进一步证实宫颈上皮脱落细胞中SHCBP1表达水平作为宫颈癌临床筛查的生物指标潜能，本研究基于细胞模型证实SHCBP1表达水平与宫颈癌细胞恶性生物学行为密切相关，推测SHCBP1可以作为患者预后标志物进行靶向药物研发。

SHCBP1定位于染色体16q11.2,通过促进体内癌细胞增殖和致瘤性发挥癌基因的作用[17-19]。在乳腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、阴茎癌、食管鳞状细胞癌、前列腺癌[20-23]中相似，SHCBP1表达较高的患者总生存时间比SHCBP1低或无表达的患者短，表明SHCBP1可以作为癌症患者的独立预后因素。同时，SHCBP1已被发现在哺乳动物细胞凋亡和耐药性的调节中发挥重要作用[21,24]。SHCBP1失调导致不受控制的细胞增殖是癌症发生的关键特征。因此，SHCBP1可能在调控细胞增殖、细胞生长和分化的信号通路中发挥作用。本研究中，宫颈上皮脱落细胞中SHCBP1表达水平随着宫颈细胞形态的异质程度深入而显著增高，推测其机制，可能是由于细胞内SHCBP1表达失衡，导致宫颈上皮细胞异常增殖及细胞周期异常，具体调控机制有待深入研究。

参考文献:

[1]王宇,宋淑芳,刘凤.我国宫颈癌流行病学特征和发病高危因素的研究进展[J].中国妇幼保健,2019,34(5):1207-1209.

[2]吴鸿滨,薛凤霞.宫颈高危型HPV持续感染与细菌性阴道病和阴道微生态相关性研究[J].中国妇幼保健,2020,35(5):797-800.

[4]吴达莹,姜瑶,李贵玲.子宫颈癌化学治疗进展[J].中国癌症防治杂志,2023,15(5):492-498.

[5]林布雷,柯瑞全.调强适形放疗联合TP方案化疗治疗中晚期宫颈癌的临床观察[J].黑龙江医药,2023,36(5):1115-1118.

基金资助:内蒙古自治区自然科学基金项目(2019MS08098); 内蒙古自治区人民医院院内基金项目(2021YN12);

文章来源:兰舒婷,孙晓梅,毛建英.SHCBP1基因表达及对宫颈癌细胞生物学行为的影响研究[J].中国妇幼保健,2024,39(22):4494-4499.