单细胞测序(single-cell sequencing)作为近年重要的技术突破发展迅速。2009年第一篇哺乳动物的单细胞测序文章发表[1],随后十余年间，单细胞技术从几十个细胞的转录组测序发展为数万个细胞的包括基因组、蛋白组、表观组、空间转录组等的多组学分析，成为解读复杂生物系统的重要方法[2,3]。目前，妇科恶性肿瘤仍是全球女性面临的巨大健康挑战，宫颈癌位居女性癌症发病及死亡第四位，子宫内膜癌和卵巢癌分别位居女性癌症发病的第六和第八位[4]。妇科恶性肿瘤是由癌细胞、血管内皮、免疫和成纤维等不同生物学行为的细胞亚群构成的复杂生态系统。由于肿瘤异质性，相同分期、解剖部位、病理类型的患者，对治疗反应及临床预后存在明显差异。传统的混池测序技术(bulk-sequencing)能获取丰富遗传学信息，其结果只代表细胞群体的平均水平，不能反应混合细胞群中单个细胞特征，难以破解肿瘤异质，阻碍临床疗效的进一步提升。单细胞测序技术在单细胞分辨率上对其基因序列、转录本、蛋白质及表观遗传学信息进行整合分析，揭示不同细胞亚群的分布及状态、作用过程及协作机制等[5],使不同类型细胞得以精准区分，为克服肿瘤的异质性提供全新前景，成为当前研究的重点和热点。

1、单细胞测序技术概述

1.1 技术流程

单细胞转录组测序(又称“单细胞RNA测序”,single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)是近几年发展最快、运用最广泛的单细胞测序技术，主要包括单细胞分离、核酸扩增、高通量测序和数据分析4个步骤。分离提取单个完整的细胞是单细胞测序的关键步骤。目前常用的单细胞分离方法主要有连续稀释法、荧光激活细胞分选、微流控技术、激光捕获显微切割等[6]。其中，连续稀释法简单易操作，对设备要求低，但是精确度不高，难以控制数量和质量[7]。荧光激活细胞分选通过特异性荧光抗体标记靶细胞并根据预定参数高效率地筛选出指定细胞[8],具有高通量、自动化等优点，但荧光标记过程可能对细胞造成损伤，具有相似标记的细胞亚群难以精准区分。微流控技术是主流的单细胞捕获技术平台，通过操纵小体积液体分离纳米级流动通道中的单个细胞[9],具有较高的分辨率和灵敏度，但对粘性细胞的捕获效率可能较低。需要指出的是，上述分选技术均需将样本制作成细胞悬液，失去了靶细胞空间结构特异性。激光捕获显微切割是在显微镜下使用脉冲紫外激光直接从组织切片上分离出细胞，可以提供靶细胞的空间信息[10],但存在显微切割工作量大、紫外线损伤靶细胞遗传信息、可能受周围细胞污染等局限性。研究者应根据自己的研究需求选择合适的靶细胞分离技术。成功获取单个细胞后进行核酸扩增，再通过不同测序方法获取转录组数据，最终完成数据处理分析获得单细胞生物学信息。

1.2 单细胞测序的发展

随着单细胞测序技术的发展，其研究范围由转录组快速扩展到单细胞全基因组、蛋白组、表观组、代谢组和空间转录组等多个组学水平。2019年，“单细胞多组学”(single-cell multimodal omics, scMulti-omics)继2013年“单细胞测序技术”后再次获评《自然》杂志年度技术。当前常见的单细胞多组学技术主要包括单细胞转录组和基因组、表观组、蛋白组或空间转录组联合的双组学技术，以及基因组、DNA甲基化和转录组的三组学技术(single-cell triple omics sequencing, scTrio-seq)。相较于单组学分析的局限性，多组学技术能够在同一细胞中捕获多维信息，更全面反映细胞特征，结合生物信息学算法和计算资源，有助于深入研究及系统理解细胞调控的复杂网络。

尽管上述单细胞测序技术带来丰富的生物学信息，由于只能在细胞裂解后进行终点测量，并不能反应细胞随时间发生的动态分子变化。基于射流显微镜(FliudFM)的活细胞穿刺技术的单个活细胞转录组测序(live-sequencing)实现了对新鲜细胞转录组的动态连续分析。其核心是对部分染色质进行微创提取和扩增，将终点测量转化为瞬时分析，实现对同一细胞基因表达的连续测量并获取单个细胞与下游分子和表型状态的联系，开辟了单细胞测序的新领域[11]。此外，微生物高通量单细胞基因组学技术(microbe-sequencing)是另一新兴的单细胞测序技术。利用微流控技术将单个微生物封装成液滴，在这些液滴中裂解、扩增整个基因组，并用带有特定序列的标签标记液滴内DNA,将所有液滴内的DNA合并，进行建库测序[12]。该技术目前主要应用于人类肠道微生物组。微生物是肿瘤微环境的重要组成，以宫颈癌为代表的妇科恶性肿瘤通过阴道与外界环境相通，易受微生物感染，微生物单细胞组学技术在肿瘤微生物领域具有极大应用潜力。

2、单细胞测序在妇科恶性肿瘤中的应用

2.1 宫颈癌

2.1.1 揭示肿瘤异质性

异质性是指缺乏一致性的不同成分组合，是生物在自然界的重要特征，也是生物多样性的保证。肿瘤内异质性是指肿瘤细胞之间的基因和表型不同，表现出组织学、免疫性、生长增殖、侵袭转移及对治疗敏感性等的差异。刘健[13]通过对宫颈鳞癌组织的12 037个单细胞进行10×Genomics测序分析，鉴定了2个上皮细胞亚群，发现1型细胞高表达PIK3R3、CENPF基因，可能通过激活PI3K/AKT通路促进细胞增殖，为癌症发生早期事件；2型细胞高表达KLK5、CEACAM1等基因，涉及细胞信号传导的基因突变，可能为癌症晚期事件。拟时序分析显示上皮细胞趋向于由1型向2型转化。复旦大学李春波团队[14]通过10×Genomics单细胞转录组测序将10 395个宫颈癌肿瘤细胞分为4个不同生物学功能的细胞簇(簇0、1、3、8),簇0细胞高表达DEFB1、KRT5、CXCL10、WARS、LY6D、CRABP2、CXCL9、PHOV、C10orf99、PRCARD,在类固醇合成、错配修复、过氧化物酶体相关信号通路富集，推测为终末期肿瘤细胞；簇1高表达CEACAM6、CD55和GJB6,基因富集分析显示主要富集免疫调节信号通路；簇3主 要富集增殖相关基因， 如MIK67、CCNB1和TOP2A,提示高增殖活性；簇8高表达干细胞相关基因SOX2和ALDH1,根据表达SOX2和ALDH1A1的干细胞样肿瘤细胞到分化癌细胞的发育过程，簇8可进一步分为6个亚群，每个亚群有特定的功能类别，显示宫颈干细胞亦具有结构层次及异质性。基于以上研究，李春波团队[15]在单细胞水平上对鳞癌和腺癌的基因组特征进行比较，确定了有效区分鳞癌和腺癌的基因，KRT6A、TP63、CDKN2A、KRT13和DSG3在鳞癌中高表达，EPCAM、MUC5B、KRT8、KRT18和AQP3在腺癌中高表达。免疫相关途径、缺氧、上皮-间充质转化和p53相关的信号通路在鳞癌来源的肿瘤细胞中高度富集。细胞周期和代谢相关的信号通路在腺癌中上调，提示细胞增殖活性增强。以上研究显示，宫颈癌肿瘤细胞具有多种亚型，通过对各亚型细胞的性质进行分析有助于精准治疗方案的推进。

2.1.2 探讨肿瘤发展规律

宫颈癌的发生历经人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染、宫颈上皮内瘤变到浸润癌。有关宫颈癌发生发展过程的研究颇多，但具体机制尚未明确。利用单细胞测序技术可鉴定出在肿瘤发生发展中发挥重要作用的细胞亚群。LI C等[16]对3例正常宫颈、2例高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)、4例宫颈癌和1例转移性淋巴结新鲜标本进行10×Genomics单细胞转录组测序，描绘宫颈癌病程进展中免疫细胞的转录图谱。结果显示：T/NK细胞是宫颈癌不同阶段的主要细胞成分(HSIL,49.4%;宫颈癌，39.4%;转移淋巴结，61.5%)。根据基因表达谱差异，鉴定出12种T细胞簇群，通过基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析对不同簇群细胞进行免疫评分，结果证明HSIL组织存在组织驻留记忆(tissue-resident memory like, TRM-like)CD8+T细胞浸润，显示低激活的免疫状态；癌组织存在耗竭型CD8+T细胞浸润，呈现免疫抑制状态；转移淋巴结以细胞毒性CD8+T细胞和效应记忆CD8+T细胞浸润为主，提示免疫应答处于早期激活阶段。该团队后续利用scRNA-seq对3例宫颈癌标本、1例阳性淋巴结和1例阴性淋巴结进行分析[17]。发现转移淋巴结的肿瘤细胞与细胞周期、免疫调节相关信号通路的高度富集有关。MRC1(CD206)在转移淋巴结中的表达水平高于肿瘤细胞，C1QA+MRC1high巨噬细胞可能与肿瘤转移有关。转移淋巴结中的肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)具有显著的抗原呈递、细胞黏附和免疫调节功能。这些发现为理解疾病进展动态变化，开发抑制不同发展阶段宫颈癌治疗方法提供深入见解。

2.1.3 描述肿瘤微环境

肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)是肿瘤生存的细胞环境，肿瘤细胞与其所处的微环境为相互作用、共同进化的整体。宫颈癌组织中非肿瘤细胞按照细胞类型包括成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、T/NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、B细胞和肥大细胞，不同细胞类型之间通过细胞通讯网络相互作用。LI C等[14]通过构建细胞-细胞通讯网络研究肿瘤、免疫细胞与内皮细胞之间的相互作用，结果显示：在肿瘤组织中，肿瘤细胞与内皮细胞之间的配体-受体对主要为免疫调节相关，包括CD74-COPA、CD74-MIF、CD74-APP等，而正常组织中，信号转导相关配体-受体对呈现高表达，主要为DSG2-DSC3、DSC2-DSG2、EGFR-TGFB1等，正常组织中内皮细胞的受体基因代表了内皮细胞的正常生物学功能；有趣的是，肿瘤细胞与内皮细胞之间的配体-受体对也在免疫细胞与内皮细胞之间表达，表明肿瘤细胞和免疫细胞的协同作用导致肿瘤血管生成。单细胞测序技术使解释肿瘤微环境中各种细胞成分的联系成为可能，为宫颈癌的治疗提供新的思路。

2.1.4 评价治疗反应

放化疗抵抗是临床上宫颈癌治疗失败的主要原因。通过单细胞测序技术有望深入了解肿瘤治疗抵抗的分子基础及提高对治疗反应的预测能力。GU等[18]对4例宫颈癌组织获得的24 371个细胞进行了单细胞转录组测序，分为9个不同的细胞群。KEGG分析显示化疗抵抗患者和化疗敏感患者之间的差异表达基因主要富集在PI3K/AKT及MAPK信号通路。YANG等[19]对从1例HPV阳性宫颈癌患者的肿瘤组织中分离出13个放疗前和12个放疗后细胞进行单细胞全基因组测序，描述肿瘤放射治疗前后的基因图谱。结果发现放疗前的主要细胞亚群在放疗后消失，而次要亚群成为主要亚群。放疗后的肿瘤细胞在POU5F1B中检测到HPV整合位点，提示在POU5F1B中存在HPV整合的肿瘤细胞更可能耐受放疗并存活；另外，放疗后细胞NFKB1基因G430E位点发生错义突变频率明显增加，功能研究显示NFKB1突变可削弱抑癌功能和宫颈癌细胞对辐射的敏感性，促进放疗后宫颈癌细胞的存活，NFKB1及其突变可能成为提升宫颈癌放疗疗效的潜在靶点[20]。

2.2 卵巢癌

2.2.1 探索肿瘤起源及分子分型

高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer, HGSOC)是致死率最高的妇科恶性肿瘤。二元论模型认为浆液性卵巢癌起源于输卵管上皮细胞。HU等[21]对6 000个非卵巢癌患者的正常输卵管上皮细胞进行Smart-seq2测序分析鉴定出六种分子亚型，通过投射到肿瘤细胞进行分型分析，验证了卵巢癌的输卵管起源学说，并根据起源细胞特征标记预测癌症发展，确定了不良预后的高上皮-间充质转化(EMT-high)亚型。拷贝数变异(copy-number alterations, CNAs)是 卵巢癌发生的重要机制。 WANG等[22]对12例HGSOC、4例非浆液性卵巢癌及6例正常输卵管组织进行单细胞多组学测序分析，发现8号染色体经常发生染色体拷贝数增加并富集肿瘤特异性上调的基因46个，8号染色体的扩增可能通过增加原癌基因MYC的表达促进卵巢癌的发生。

单细胞测序技术通过挖掘肿瘤异质性推动肿瘤分子分型的进一步明确，促进个体化治疗的发展。HAO等[23]对2例HGSOC患者的原发和转移病灶进行了单细胞转录组测序，根据基因标记将上皮细胞可分为5个不同功能的亚群(EC1-EC5)。EC5亚群细胞高表达增殖标记物Ki-67、DNA损伤通路相关基因及化疗抵抗基因，是最具侵袭性的上皮细胞亚群；EC2亚群富含纤毛上皮标记物FOXJ1、PIGR、CAPS和GDF15,验 证输卵管上皮为卵巢癌的起源。 IZAR等[24]利用10×Genomics和Smart-seq2方法对11例HGSOC患者的恶性腹水标本进行单细胞RNA测序，鉴定出18个细胞亚群。对比癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)鉴定的卵巢癌分子亚型(分化型、增生型、间质型和免疫反应型),发现绝大多数肿瘤细胞表达高分化特征，仅一簇肿瘤细胞高表达增殖标记，基本不表达间质型和免疫反应型标记，而由肿瘤相关成纤维细胞和巨噬细胞分别高表达，提示TCGA分型主要反应的是肿瘤生态系统组成，而非肿瘤细胞本身的分子特征。基因分析发现肿瘤与非肿瘤细胞均高表达JAK/STAT通路相关基因，JAK/STAT通路抑制剂JSI-124能明显抑制卵巢癌细胞活力，可作为高级别浆液性卵巢癌患者的治疗选择。

2.2.2 肿瘤转移与耐药研究

单细胞测序能帮助发现肿瘤转移过程中的分子变化，在肿瘤转移机制研究中发挥重要作用。腹腔转移和淋巴结转移是卵巢癌常见的两种转移模式。WANG等[22]的研究发现，多数卵巢癌患者同一个遗传谱系的肿瘤细胞转移到腹腔后只有极少数基因发生表达变化，而淋巴结转移前后有两千多个基因的表达发生显著改变，提示腹腔微环境对肿瘤细胞的基因表达模式影响小，肿瘤发生的早期阶段即已获得腹腔转移能力；CCN1和HSP90AA1在发生转移的肿瘤谱系中表达上调，敲除CCN1活性或抑制HSP90AA1活性后肿瘤迁移及侵袭力降低，可能作为卵巢癌的潜在治疗靶点。LIN等[25]对卵巢癌患者的肿瘤、癌旁及腹膜转移组织进行单细胞测序和免疫组化分析，发现STC1在卵巢癌组织中表达高于癌旁，在腹膜转移组织中进一步表达增强，体外和体内发现STC1可促进卵巢癌的转移、 脂质代谢和顺铂耐药通过 FOXC2/ITGB6信号轴。ZHAO等[26]通过单细胞测序鉴定出PEG10+的癌胚型上皮细胞能够促进干细胞自我更新，并通过NOTCH信号通路增强顺铂耐药。南方医科大学宁云山团队[27]利用单细胞转录组测序和TCR/BCR测序对1例铂类化疗耐药的复发HGSOC患者不同阶段的肿瘤组织、腹水和外周血单核细胞(PBMC)进行分析，发现肿瘤细胞EC3亚群的化疗耐药相关基因的高表达，且主要处于G2/M期，同时代谢水平升高，导致HGSOC的进展和铂类化疗耐药。单细胞TCR/BCR测序显示化疗诱导PBMC来源的T细胞衰老，改变了TCR/BCR的克隆性增殖，为复发铂类耐药的HGSOC免疫环境的研究奠定基础。

2.2.3 预后预测

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)与大多数肿瘤的预后密切相关。LAUMONT等人[28]通过单细胞测序等技术鉴定出CD39、CD103和PD-1(“三阳”表型)为高度活化的TIL,携带“三阳”TIL表型的肿瘤患者的生存期显著长于其它标记组合。ANADON等[29]通过流式细胞术和单细胞测序鉴定出共表达CD103和CD69的TRM-like CD8+T细胞，TRM-like T细胞具有肿瘤免疫原性，当与CD8+循环T细胞(CD103-)高比值时能预测较长的卵巢癌患者总生存时间。

2.3 子宫内膜癌

2.3.1 刻画肿瘤微环境的异质性

肿瘤异质性不仅表现为上皮细胞基因及表型的多样性，还包括肿瘤微环境中具有高度异质性的成纤维细胞、免疫细胞等。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境中最丰富的细胞组分，是公认的肿瘤发展调节剂。YU等[30]对4例子宫内膜癌组织和2例正常子宫内膜组织进行单细胞转录组测序，将CAFs分为4个特征明显的亚群：基质CAFs、炎症性CAFs、抗原递呈CAFs及血管CAFs, 血管CAFs能够预测较差的生存并作为治疗的潜在靶点；配体-受体分析显示肿瘤细胞与CAFs之间存在频繁的交互作用，共同促进子宫内膜癌的恶性进展。

2.3.2 鉴定肿瘤标志物

开发新的生物标志物在早期诊断肿瘤并对疾病进展进行监测是有价值的研究方向。COCHRANE等人[31]对正常子宫内膜进行单细胞转录组测序，发现了MPST及FAM92B、WDR16、DYDC2可分别作为分泌型及纤毛型上皮细胞的特异性新标记，这些分子在子宫内膜癌中均有表达，且能作为肿瘤的预后预测标记物。特别要指出的是，分泌型上皮标记物MPST的表达能在子宫内膜癌的ProMiSE分子分型的基础形成有效分层，进一步提升预后预测效果。

3、小结和展望

单细胞测序技术在更高分辨率水平刻画肿瘤各细胞类群特征及其发育轨迹，单细胞组学数据库的构建为有效挖掘海量单细胞数据提供了解决方法[32],推动了肿瘤研究的进展。我国对单细胞测序技术的发展给予重点支持，目前单细胞领域论文数量位居全球第2位[33],妇科恶性肿瘤领域的论文数量也呈现快速增长趋势。然而，妇科恶性肿瘤的单细胞测序应用及研究尚处于初级阶段，有许多未知待进一步阐明。首先，已报道研究主要为小样本的描述性结果，具有患者个体特异性，距离临床转化应用存在较大距离；第二，测序样本的选择缺乏针对性，临床诊疗中的难题比如宫颈胃型腺癌、神经内分泌癌等特殊病理类型的肿瘤，以及原发治疗抵抗的肿瘤等仍有待研究；第三，测序数据多局限于单组学，使用多组学测序同一细胞的多种分子有待加强实践。未来随着测序技术在高通量及自动化的提升及成本的降低，单细胞测序技术将在妇科肿瘤研究中获得更广泛应用，加快推动精准医学发展。

参考文献:

[3]田济铭,周凯翔,杨永秀,等.单细胞多组学测序技术进展及其在肿瘤研究中的应用[J].中国癌症防治杂志,2020,12(06):643-649.

[13]刘健.基于单细胞转录组测序技术对宫颈恶性肿瘤异质性及相关基因的研究[D].吉林:吉林大学,2021.

[32]蔡浩洋.单细胞组学数据库的研究进展[J].四川师范大学学报(自然科学版),2022,45(04):452-461.

[33]蒋甜,许哲平,尹传昊,等.我国单细胞技术发展态势分析[J].科学观察,2022,17(01):1-16.

基金资助:国家自然科学基金(编号:82160562);云南省高层次科技人才及创新团队选拔专项(编号:202305AS350020);

文章来源:彭澜,李政,张岚.单细胞测序在妇科常见肿瘤中的应用进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(08):1527-1531.