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关于曲克芦丁原料药及母液粉结构分析与三羟乙基芦丁及其他羟乙基芦丁衍生物含量测定

2020-06-18 463 上传者：管理员

摘要：目的采用反相高效液相色谱法测定曲克芦丁原料药及母液粉中三羟乙基芦丁及其他羟乙基芦丁衍生物的含量,并采用NMR对其进行结构确证。方法采用AglientTC-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%HAc水溶液(20:80),流速0.5mL•min-1,检测波长254nm。结果在最优色谱条件下,曲克芦丁原料药及母液粉中主成分三羟乙基芦丁及其他羟乙基芦丁衍生物均获得了较好的分离效果,采用NMR确定了结构。结论所用方法简便、准确,灵敏度高,可用于曲克芦丁原料药及母液粉中主成分及相关物质的含量测定,为曲克芦丁原料药的质量控制及曲克芦丁母液的二次开发提供了依据。

关键词：
分析化学
原料药
曲克芦丁
核磁共振波谱
母液粉
结构确证
羟乙基芦丁衍生物
芦丁
质量控制
高效液相色谱法
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曲克芦丁是一种治疗脑血管疾病的常用药,又称维生素P4,商品名为维脑路通,化学名3′,4′,7-三[O-(2-羟乙基)-5羟基黄酮-3]-芸香苷(图1)。曲克芦丁具有抑制红细胞和血小板凝聚,防止血栓形成,促进新血管生成以增进侧支循环等作用;能够降低毛细血管通透性和脆性,防止因血管通透性升高引起的水肿;并有抗过敏、清除自由基、抗放射性损伤、抗炎症、抗溃疡等多种生理活性[1,2,3,4]。曲克芦丁是由芦丁经羟乙基化的半合成产物,由于芦丁中存在4个解离羟基,理论上有15种羟乙基芦丁形成;其他羟乙基化组分,如四羟乙基槲皮素也少量存在,各衍生物间性质接近,难以分离、纯化[5,6,7,8]。基于上述原因,目前市售的曲克芦丁原料药是以三羟乙基芦丁(亦称为曲克芦丁)为主的羟乙基芦丁混合物,其他成份包括单羟乙基芦丁、二羟乙基芦丁、三羟乙基芦丁异构体和四羟乙基芦丁等,其中,药效最强的是三羟乙基芦丁,因此,其他羟乙基芦丁衍生物的含量需要在药品质量标准中加以控制[9,10,11,12]。同时,由于各羟乙基衍生物难以分离、纯化,将引起曲克芦丁母液中有效成分三羟乙基芦丁含量较高。因此,为同时监控曲克芦丁原料药和母液粉中三羟乙基芦丁及其它羟乙基芦丁衍生物的含量,现建立了HPLC法对6批曲克芦丁原料药及3批母液粉进行分析检测,并采用NMR进行结构确证,为曲克芦丁原料药的质量控制和曲克芦丁母液的二次开发提供了依据。

图1曲克芦丁的化学结构式

1、实验部分

1.1仪器与试药

1260系列高效液相色谱仪(美国Agilent)。曲克芦丁对照品(纯度≥98%,自制);曲克芦丁口服原料药、曲克芦丁注射原料药、曲克芦丁母液粉(市售);乙腈为色谱纯;冰乙酸为分析纯;水为纯净水。

1.2方法与结果

1.2.1色谱条件

采用AglientTCC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%HAc水溶液(20:80),流速0.5mL·min-1,检测波长254nm,柱温30℃。色谱图见图2。

图2曲克芦丁对照品(A)、四羟乙基芦丁对照品(B)、曲克芦丁原料药(C)和曲克芦丁母液粉(D)溶液的色谱图

1.2.2溶液的制备

精密称取曲克芦丁对照品适量,加流动相溶解并定容,得570μg·mL-1对照品贮备液。取上述对照品贮备液,用流动相按不同倍数进行稀释,得285、142.5、114、57、28.5、5.7μg·mL-1曲克芦丁系列对照品溶液,于4℃冷藏备用。称取不同批次的曲克芦丁原料药及母液粉适量,置25mL量瓶中,分别加入流动相溶解并定容,过0.45μm微孔有机滤膜,即得供试品溶液。

1.2.3线性关系的考察

精密吸取“1.2.2”项下系列对照品溶液各10μL,按“1.2.1”项色谱条件进样测定,记录色谱图。以进样浓度(μg·mL-1)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归,得回归方程:Y=28.474X+18.257(r=0.9995),5.7～285μg·mL-1曲克芦丁与峰面积的线性关系良好。

1.2.4色谱柱的选择

目前生产和使用的曲克芦丁是以三羟乙基芦丁为主的羟乙基芦丁混合物,各衍生物的性质接近,色谱保留行为接近。为获得较好的分离,考察了不同色谱柱的分离效果。分别采用VenusilASB-C18(250mm×4.6mm,5μm)、AgilentEclipsePlus-C18(100mm×4.6mm,3.5μm)、AgilentTC-C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,测定同一批样品,色谱条件见表1。由图3可见:样品在后两种柱上的分离效果较好;在第一种柱上色谱峰出现拖尾,基线略有漂移。同时,结合成本分析,由于填料粒径为3.5μm的色谱柱价格昂贵,最终选用AgilentTC-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。

表1不同色谱柱的比较

图3AgilentTC-C18(A)、AgilentEclipsePlus-C18(B)和VenusilASB-C18(C)色谱柱分离曲克芦丁的色谱图

1.2.5精密度、重复性与稳定性的试验

取“1.2.2”项制备的114μg·mL-1曲克芦丁对照品溶液,按“1.2.1”项色谱条件连续进样5次,记录峰面积,计算得峰面积的RSD=0.36%(n=5),表明精密度良好。称取曲克芦丁原料药(批号:ZS170501)适量,按“1.2.2”项方法平行配制5份供试品溶液,分别进样测定,记录峰面积,计算得峰面积的RSD=1.18%(n=5),表明方法的重复性良好。精密吸取“1.2.2”项制备的对照品和供试品溶液各10μL,分别于0、2、4、6、8、12、24h时进样测定,计算得峰面积的RSD分别为0.85%、1.04%,表明对照品溶液和供试品溶液在24h内稳定。

1.2.6回收率试验

称取已知含量的曲克芦丁供试品(批号:KF170507)适量,共9份,分别加入曲克芦丁对照品适量,按“1.2.2”项方法,分别配制高(120%)、中(100%)、低(80%)3个水平的供试品溶液各3份,分别进样测定,记录色谱峰面积并计算加样回收率(表2)。结果曲克芦丁在高、中、低浓度下,加样回收率分别为99.93%、99.88%、99.65%,RSD分别为0.55%、0.49%、0.67%,表明方法的回收率良好。

表2回收率的试验结果(mg,n=9)

1.2.7样品的含量测定

分别称取6批次曲克芦丁原料药及3批次曲克芦丁母液粉适量,按“1.2.2”项方法制备样品溶液,进样测定并记录峰面积。采用外标法,将峰面积代入标准曲线计算主成分三羟乙基芦丁的含量,按照面积归一化法计算其他羟乙基芦丁衍生物的相对含量,测定结果见表3。由表3可知:3批口服原料药中三羟乙基芦丁的含量大于84%,3批注射原料药中三羟乙基芦丁的含量大于90%,均符合曲克芦丁原料的质量标准。曲克芦丁母液粉中有效成分三羟乙基芦丁的含量较高(>20%)。

表3曲克芦丁原料药和母液粉的测定结果

1.2.8曲克芦丁及四羟乙基芦丁的结构鉴定

市售曲克芦丁(三羟乙基芦丁)对照品的价格昂贵,纯度不高(仅95%),因此,实验所用对照品为自制。采用半制备型HPLC对曲克芦丁口服原料药进行分离纯化,分别制得纯度较高的曲克芦丁(三羟乙基芦丁,A)和四羟乙基芦丁(B),经HPLC分析检测,纯度>98%。样品A的1HNMR(D2O):δ7.48(1H,2′-H),7.23(1H,6′-H),6.68(1H,5′-H),6.03(1H,8-H,6-H),0.90、0.91(3H,12″-H);4.97、4.97(1H,1″-H),4.40(1H,7″-H),3.08～4.02(糖基上的-CH、-CH2)。13CNMR(D2O):δ180.178(C=O),167.177(C-7),162.372(C-9),159.029(C-5),158.484(C-3′),153.142(C-4′),149.127(C-2),136.933(C-3),125.458(C-1′),124.510(C-6′),116.133(C-5′),114.481(C-2′),107.605(C-10),105.132(C-8),103.670(C-6),100.846(C-7″),96.344(C-1″),78.460(3′,4′-OCH2-),77.875(7-OCH2-),76.863(C-10″),74.485(C-2″),73.023(C-8″),72.746(C-5″),72.691(C-3″),72.619(C-9″),72.564(C-4″),71.513(C-11″),70.454(C-6″),62.788,62.670(-CH2OH),19.402(C-12″)。根据以上氢谱、碳谱数据,参考相关文献[8,11],确定样品A为三羟乙基芦丁。样品B的1HNMR(D2O):δ7.67(1H,2′-H),7.43(1H,6′-H),6.90、6.89(1H,5′-H),6.37(1H,6-H),6.31(1H,8-H),0.95(3H,12″-H),5.05(1H,1″-H),4.49(1H,7″-H),3.16～4.16(糖基上的-CH、-CH2)。13CNMR(D2O):δ177.483(C=O),166.427(C-7),162.048(C-9),160.823(C-5),157.157(C-3′),152.921(C-4′),149.183(C-2),138.956(C-3),125.395(C-1′),124.826(C-6′),116.386(C-5′),114.655(C-2′),110.830(C-10),105.298(C-8),103.757(C-6),100.106(C-7″),96.921(C-1″),78.641(3′,4′-OCH2-),78.072(5,7-OCH2-),77.021(C-10″),74.445(C-2″),73.868(C-8″),72.951(C-5″),72.793(C-3″),72.651(C-9″),72.580(C-4″),71.521(C-11″),70.912(C-6″),62.844,62.780,62.741,62.670(-CH2OH),19.307(C-12″)。对比样品A与样品B的氢谱、碳谱数据,确定样品B为四羟乙基芦丁。

2、讨论

曲克芦丁产品中主成分三羟乙基芦丁及芦丁的其他羟乙基衍生物的结构、性质接近,不易分离。曲克芦丁是由芦丁经羟乙基化的半合成产物,结构中含有酚羟基和醇羟基,显弱酸性。在弱酸性化合物的色谱分离过程中,通常向流动相中加入酸性物质来抑制弱酸性化合物电离,使样品处于分子状态,以减少色谱峰的拖尾或前伸。实验考察了0.1%冰乙酸、0.1%甲酸、0.1mol·L-1磷酸盐缓冲溶液对色谱峰分离效果的影响,综合考虑色谱峰型、保留时间及峰面积。最终选择0.1%冰乙酸-乙腈(80:20)作为流动相。文中所建立的曲克芦丁原料药及母液粉的HPLC分析方法,具有流动相组成简单、高效快速、回收率高、精密度和重复性良好等特点,可用于曲克芦丁原料药及母液粉中主成分三羟乙基芦丁及其他羟乙基芦丁衍生物的分离、测定。通过对曲克芦丁母液粉进行分析检测,发现其有效成分三羟乙基芦丁在曲克芦丁母液粉中的含量较高(≥20%),该结果进一步说明了对曲克芦丁母液进行分离纯化、回收有效成分三羟乙基芦丁,具有重要的经济价值和社会效益。文中结果为曲克芦丁原料药的质量控制提供了实验依据。

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基金:陕西省科技厅项目(编号:2018JM7060);西安市未央区科技计划项目(编号:201930);西安医学院药学省级重点学科建设项目(编号:2016YXXK09).