地稔Melastoma dodecandrumLour.为野牡丹科野牡丹属植物，也称铺地锦、金头石榴、地茄等[1],广泛分布于我国长江以南各省区，包括贵州、广西、福建等地[2-3]。地稔新鲜或干燥全株药用，畲族、瑶族、苗族等少数民族使用较多，主治产后腹痛、崩漏带下、子宫出血、盆腔炎、子宫癌和食道癌等[4-5]。地稔主要含有黄酮类、酚酸类、多糖及挥发油等化学成分[6]。网络药理学研究提示，地稔中没食子酸、3-甲氧基鞣花酸、原儿茶酸等多酚类物质为其治疗宫颈癌的有效成分[7],此外，地稔中的牡荆素、芦丁、鞣花酸、丁香酚等亦为多酚类物质，均可通过诱导宫颈癌细胞凋亡与细胞周期阻滞，发挥抗宫颈癌疗效[8-14]。近年来，多酚类物质在抗宫颈癌药物的研发中备受人们关注。

目前，多酚类化合物纯化方法主要有溶剂萃取法、大孔树脂吸附法、高速逆流色谱法、膜技术等[15-16],其中，大孔树脂吸附法因具有操作简便、选择性高、易于再生、适合工业化生产等优势，在中药有效成分的分离纯化方面应用极为普遍[17-18]。本课题组前期优选了地稔总多酚的提取工艺，得出43%乙醇为提取溶剂时提取率最优[19],但体外抗宫颈癌研究发现，以水和42%乙醇为提取溶剂分别制成地稔提取物(生药浓度均为0.19 g/mL),地稔水提物抑制宫颈癌细胞增殖的作用优于醇提物。鉴于此，本研究以水为提取溶剂，采用大孔树脂吸附法分离纯化地稔水提液总多酚，以地稔总多酚吸附率、解吸率为评价指标，筛选最佳树脂并阐明吸附机理；运用单因素试验优化大孔吸附树脂纯化工艺参数并验证；以Hela细胞增殖抑制率为考察指标，采用CCK-8法比较地稔纯化前后的抗宫颈癌活性，为民族药地稔抗宫颈癌药物的研发提供依据。

1、仪器与材料

1.1 仪器

紫外分光光度计(UV-5900,上海分析仪器有限公司);电子天平(FA2204N,上海菁海仪器有限公司);高速多功能粉碎机(JP-150A,永康市久品工贸有限公司);数显恒温水浴锅(HH-2,常州市华普达教学仪器有限公司);振荡培养箱(BS-IEA,常州市华普达教学仪器有限公司);电热恒温水浴锅(DK-S22,上海精宏实验设备有限公司);旋转蒸发仪(N-1300,上海爱朗仪器有限公司);CO2培养箱(BB150,美国Thermo Fisher Scientific公司);全波长酶标仪(1550,美国Thermo Fisher Scientific公司);倒置相差显微镜(CKX53,日本Olympus公司);洁净工作台(CJV1500-Y,山东新华医疗器械股份有限公司);高速冷冻离心机(X-30R,美国贝克曼库尔特有限公司);数控超声波清洗器(KQ-300DB,昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药与试剂

地稔于2022年10月采自贵州省龙里县民主乡，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为野牡丹科植物地稔Melastoma dodecandrumLour.的全株；没食子酸对照品(购于中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605,纯度为91.50%);福林酚试剂、DM-301、NKA-9、HPD-500树脂(购于上海蓝季科技发展有限公司);胎牛血清(购于以色列生物工业有限公司);青链霉素混合液(购于赛澳美细胞技术[北京]有限公司);MEM培养基(购于赛默飞世尔生物化学制品[北京]有限公司);CCK-8试剂盒(购于上海陶术生物科技有限公司);蒸馏水(自制);其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞株

人宫颈癌Hela细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

2、方法

2.1 水提液制备

称取地稔药材粗粉适量，加20倍量水煎煮1 h, 过滤，收集滤液；滤渣加15倍量水煎煮1 h, 过滤，收集滤液；合并两次滤液，减压浓缩至相应生药浓度，即得地稔水提液，备用。

2.2 没食子酸标准曲线建立

精密称取没食子酸对照品1.30 mg, 置于25 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.052 mg/mL没食子酸对照品溶液。分别精密吸取没食子酸对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL棕色容量瓶中，按照课题组前期建立的方法[20]测定吸光度A。以没食子酸质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：A=0.124 9C-0.005 7 (r=0.999 9),即没食子酸浓度在1.04～6.24 μg/mL范围内，与吸光度呈良好线性关系。

2.3 大孔树脂预处理

分别取3种型号的大孔吸附树脂适量，先用蒸馏水洗至无白色悬浮物及杂质，除去树脂表面残留水分，用2倍量95%乙醇浸泡24 h, 使其充分溶胀后再用95%乙醇反复淋洗至淋出液加蒸馏水混合无白色沉淀，用蒸馏水洗至无乙醇味，抽滤去水，备用。树脂类型及其物理参数见表1。

表1 3种大孔树脂类型及物理参数

2.4 大孔树脂型号筛选

称取预处理好的各类型树脂4 g, 置于250 mL具塞锥形瓶中，加50 mL生药浓度为0.19 g/mL的地稔水提液，于恒温振荡培养箱(30 ℃,120 r/min)振荡24 h, 于0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 h吸取上清液1 mL,即得不同时间点吸附液。24 h后取出树脂，水冲洗树脂表面残留溶液，滤纸吸干树脂表面水分，置于250 mL具塞锥形瓶中，加50%乙醇50 mL,于恒温振荡培养箱(30 ℃,120 r/min)振荡10 h, 于0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 h吸取上清液1 mL,即得不同时间点解吸液。按照“2.2”项下方法测定不同时间点吸附液、解吸液中总多酚质量浓度，通过公式(1)、(2)计算总多酚吸附率及解吸率，并绘制3种型号大孔树脂的静态吸附与解吸动力学曲线，公式(1)、(2)如下所示：

2.5 NKA-9大孔树脂吸附动力学考察

基于“2.4”项下实验数据，分别采用拟一阶、拟二阶吸附动力学模型及颗粒内扩散Kannan方程对NKA-9型大孔树脂的吸附过程进行拟合，预测其吸附动力学行为。拟一阶动力学模型常用于模拟固液吸附体系，拟二阶动力学模型用McKay方程进行描述，二者及颗粒内扩散Kannan方程的表达式见公式(3)、(4)、(5)[21-23]。

拟一阶动力学方程：ln(qe-qt)=-k1t+lnqe公式(3)

粒子扩散动力学方程：

式中，qe为平衡吸附量，qt为t时刻吸附量，k1、k2与kd分别为相应模型速率常数，c为常数。

2.6 NKA-9大孔树脂纯化工艺参数优选

2.6.1 上样液生药浓度考察

精密称取6份预处理NKA-9树脂5 g, 置于25 mL具塞锥形瓶中，分别加入生药浓度为0.11、0.15、0.19、0.23、0.27、0.31 g/mL的地稔水提液10 mL,于恒温振荡培养箱(30 ℃,120 r/min)振荡12 h, 过滤，收集滤液，按照“2.2”项下方法测定吸光度，计算吸附率。

2.6.2 上样液体积考察

准确称量预处理NKA-9树脂10 g, 湿法装入层析柱，得大孔树脂柱(1 BV=18 mL),用生药浓度为0.19 g/mL的地稔水提液上柱，以1 mL/min流速进行动态吸附，分段收集流出液，按照“2.2”项下方法测定吸光度，计算地稔总多酚质量浓度，并以上样液体积(BV)为横坐标，流出液浓度(μg/mL)为纵坐标，绘制动态泄露曲线。

2.6.3 上样液流速考察

精密称取5份NKA-9树脂5 g, 预处理后湿法装柱(1 BV=9 mL),加入生药浓度为0.19 g/mL地稔水提液1 BV,调节上样流速为1、2、3、4、5 mL/min, 先以5 BV蒸馏水洗脱，弃去水洗脱液，再以50%乙醇3.3 BV洗脱，收集醇洗脱液，按照“2.2”项下方法测定吸光度，计算吸附率。

2.6.4 洗脱剂浓度考察

称取吸附平衡NKA-9树脂1 g, 置于50 mL具塞锥形瓶内，分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇25 mL,于恒温振荡培养箱(30 ℃,120 r/min)振荡解吸4 h, 过滤去除树脂，按照“2.2”项下方法测定滤液吸光度，计算解吸率。

2.6.5 洗脱剂体积考察

取NKA-9树脂10 g, 预处理后湿法装入层析柱(1 BV=18 mL),按照“3.1～3.3”项下最佳工艺上柱，先用5 BV蒸馏水洗脱，弃去水洗脱液，再用50%乙醇2 mL/min洗脱，每0.28 BV收集1份醇洗脱液，按照“2.2”项下方法测定吸光度，计算总多酚质量浓度，并以洗脱剂体积(BV)为横坐标，洗脱液浓度(μg/mL)为纵坐标，制作动态解吸曲线。

2.6.6 洗脱剂流速考察

称取4份NKA-9树脂3 g, 预处理后湿式装入层析柱(1 BV=5.4 mL),按照“3.1～3.3”项下最佳工艺上样，先用5 BV蒸馏水洗脱，弃去水洗脱液，再加入流速分别为1、2、3、4 mL/min的50%乙醇3.3 BV洗脱，收集醇洗脱液，按照“2.2”项下方法测定吸光度，计算解吸率。

2.7 纯化工艺验证

分别称取30 g NKA-9树脂3份，根据优选纯化工艺参数试验，按照“2.2”项下方法测定吸光度，计算纯化前后地稔总多酚含量，并运用公式求出转移率，见公式(6)。

2.8 抗宫颈癌活性试验

取地稔药材粗粉适量，按照“2.1”项下方法制备地稔水提液(生药浓度为0.19 g/mL),将部分水提液浓缩、干燥，得粗提物；剩余水提液经纯化工艺处理，得纯化物，备用。选择生长状态良好的Hela细胞，以5×103个/孔接种于96孔板中，每孔体积0.1 mL,于37 ℃、5%CO2培养箱孵育，待细胞贴壁，吸弃培养基。加入不同浓度粗提物(12.5、25、50、100、200 μg/mL)与纯化物(3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL),空白对照组不作药物处理，各浓度设6个复孔。孵育24 h, 向每孔加入10 μL CCK-8,继续孵育2 h, 于450 nm波长处检测吸光度A。试验重复3次，运用公式计算细胞增殖抑制率，见公式(7),并使用SPSS 26.0统计软件分析IC50值。

3、结果

3.1 大孔树脂型号筛选结果

由图1可知，不同型号大孔树脂对地稔总多酚的吸附率和解吸率有差异，但均在12 h与4 h达到吸附与解吸平衡，其中NKA-9、DM-301在吸附过程中表现较佳，但DM-301解吸率较低，故筛选NKA-9大孔树脂对地稔中总多酚进行纯化。

图1 3种大孔树脂静态吸附(A)与解吸(B)动力学曲线

3.2 NKA-9大孔树脂吸附动力学考察结果

由表2和图2可知，拟二阶动力学模型能够很好地描述该吸附动力学行为(r=0.999 5),运用公式(4)计算得qe理论值与实际值更接近；吸附过程0.7～1.5 h,qt与

基本呈一条直线，表明该时段吸附速率主要由颗粒内扩散控制，1.5 h后直线开始偏移，且直线未经过原点，提示吸附速率还受到边界效应、表面吸附作用的影响[24]。

表2拟一阶、拟二阶动力学模型参数及相关系数

拟合模型 动力学方程 拟合方程 动力学参数相关系数r

拟一阶 ln(qe-qt)=-k1t+lnqe Y=-0.220 4X+2.406 0 k1=0.220 4qe=11.089 5 0.944 9

拟二阶 tqt=1k2×qe2+tqe Y=0.388 0X+0.336 8 k2=0.447 0qe=2.577 3 0.999 5

图2颗粒内扩散模型拟合曲线

3.3 NKA-9大孔树脂纯化工艺参数优选结果

3.3.1 上样液生药浓度确定

由图3可知，随着上样液生药浓度增加，树脂吸附率逐渐增大，当上样液生药浓度为0.19 g/mL时吸附率达到最大值72.73%,继续增大浓度，吸附率逐渐减小。造成该现象原因：上样液生药浓度低，单位时间内树脂吸附量少，导致吸附率低；上样液生药浓度高，溶液中杂质含量增加并与多酚类物质产生竞争吸附[25],降低吸附效果，故优选上样液生药浓度为0.19 g/mL。

图3上样液生药浓度优选结果

图4动态泄露曲线

3.3.2 上样液体积确定

由图4可知，当上样液体积约0.28 BV时，流出液浓度急剧增大，继续增加上样液体积，流出液浓度缓慢增大，当上样液体积达1 BV后，流出液浓度趋于平缓，即大孔树脂此时已吸附饱和，后续再增大上样液体积将浪费样品溶液，故优选上样液体积为1BV。

3.3.3 上样液流速确定

由图5可知，随着上样液流速不断加快，吸附率呈下降趋势。这是由于流速增加，地稔中多酚类物质在柱内停留时间短，未能扩散到树脂层与树脂充分接触便快速流出柱体，吸附率降低，故优选上样液流速为1 mL/min。

图5上样液流速优选结果

3.3.4 洗脱剂浓度确定

由图6可知，50%乙醇对应解吸率最高，减小或增大乙醇浓度，解吸率均下降。这归因于乙醇浓度过低导致洗脱不完全，过高则醇溶性杂质增多，且浪费试剂，故从解吸率与节约成本的角度考虑，优选洗脱剂乙醇浓度为50%。

图6洗脱剂浓度优选结果

3.3.5 洗脱剂体积确定

由图7可知，随着洗脱剂体积增加，流出液浓度先缓慢上升后迅速上升，当洗脱剂体积达到0.83 BV时，流出液浓度达到最大；之后继续加大洗脱剂体积，流出液浓度逐渐下降；当洗脱剂体积为3.3 BV时，流出液浓度降至最低且后续基本无波动，说明3.3 BV洗脱剂即可将总多酚洗脱完全，故优选洗脱剂体积为3.3 BV。

图7动态解吸曲线

3.3.6 洗脱剂流速确定

由图8可知，当洗脱剂流速>2 mL/min时，解吸率随着流速增加而迅速降低，原因是洗脱流速过快，洗脱剂还未来得及置换树脂上吸附的多酚类物质就已流出，解吸不完全。当洗脱流速<2 mL/min时，解吸率略有降低，可能是流速过慢使得多酚分子再吸附增加，故优选洗脱剂流速为2 mL/min。

图8洗脱剂流速优选结果

3.4 纯化工艺验证结果

由表3可知，纯化前地稔提取物总多酚的含量为21.18%,纯化后为61.05%,即总多酚含量提高约3倍，且转移率达75.25%,表明筛选的纯化工艺稳定可靠。

表3纯化工艺验证结果

3.5 抗宫颈癌活性试验结果

随着样品浓度增大，纯化物抑制率急剧上升，粗提物呈缓慢增长趋势，同等浓度(12.5、25、50 μg/mL)下粗提物抑制率5.62%、8.59%、18.52%,纯化物抑制率76.02%、83.72%、89.36%,即纯化后抑制率分别提高13.5、9.75、4.82倍，样品浓度低时，纯化物抑制率提高程度大；3次重复试验粗提物IC50值为191.781 μg/mL,纯化物IC50值为7.096 μg/mL,提示地稔总多酚纯化后抗宫颈癌活性显著增强，纯化工艺研究具有实际意义。见图9、表4。

图9细胞增殖抑制率结果

表4粗提物、纯化物IC50值结果(μg·mL-1)

4、讨论

据报道，多酚类成分具有良好的抗癌活性，课题组前期测定地稔药材中多酚类物质含量为1.97%～6.17%[20],地稔水提取物具有抑制宫颈癌细胞增殖的作用，但其药效物质基础尚未明确。本研究采用大孔树脂吸附法富集纯化地稔中多酚类成分，并考察其抗宫颈癌药效，为研究地稔抗癌药效物质基础提供参考。

多酚类物质的化学结构含有较多羟基[26],具备较强的极性与亲水性，易与树脂形成氢键进而被分离与释放，为此，本研究以NKA-9、HPD-500及DM-301共3种中等极性以上大孔树脂为考察对象，从中筛选最佳树脂，结果显示，NKA-9大孔树脂具有较高的吸附率与解吸率。此外，从物理性质角度分析，适当增大大孔吸附树脂的比表面积或调整平均孔径能够提高其吸附与解吸能力[27]。

NKA-9型大孔树脂的吸附动力学考察发现，对地稔中多酚类成分的吸附符合拟二阶动力学模型(r= 0.999 5)。吸附过程以化学吸附为主，与吸附质-吸附剂之间的电子对共用或转移有关；吸附速率决定于吸附剂表面上未结合吸附质位点数目的平方值[28-29],影响因素包含颗粒内部扩散、边界效应及表面吸附作用等[30]。

通过单因素试验确定最佳纯化工艺条件：优选NKA-9型大孔树脂，将1 BV生药浓度为0.19 g/mL地稔水提液以1 mL/min速度上样，用3.3 BV 50%乙醇以2 mL/min流速洗脱。经验证，纯化后总多酚含量提高约3倍，转移率为75.25%,说明优选的纯化工艺环保、稳定、可靠，适用于地稔总多酚的分离纯化。需注意，地稔水提液浓缩过程中有暗灰色泥状沉淀析出，直接上样将会造成树脂堵塞，降低吸附、解吸效果，需离心去除；地稔水提液含有多糖、蛋白质及鞣质等水溶性大分子也会影响树脂纯化，经探索可先用5 BV蒸馏水洗至近无色，再用50%乙醇洗脱。

Hela细胞是一种常见的宫颈癌细胞，选择CCK-8法测定Hela细胞增殖抑制率，考察地稔纯化前后抑制宫颈癌细胞的活性。结果，地稔粗提物IC50值为(191.781±2.03)μg/mL,纯化物IC50值为(7.096±0.46)μg/mL,且粗提物起效浓度高于纯化物4倍，纯化后抑制率提高约9倍，说明优选的纯化工艺可显著提高地稔抗宫颈癌作用，下一步将对地稔总多酚的成分鉴定、其他生物活性、体内抗宫颈癌作用及其机制等展开研究。

本研究选择NKA-9型大孔吸附树脂纯化地稔总多酚，成本低、安全性好，制备总多酚含量高，工艺过程中仅用水、乙醇为溶剂，绿色环保，产业化前景广阔，可为中药多酚类成分的富集纯化提供参考。

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基金资助:国家自然科学基金项目(81860695);贵州省中央引导地方科技发展资金项目(黔科中引地[2022]4016);贵州省教育厅滚动支持省属高校科研平台团队项目(黔教技[2022]022);

文章来源:班积变,麻秀萍,钱松,等.地稔总多酚纯化工艺优化及其抗宫颈癌活性研究[J].贵州中医药大学学报,2024,46(06):43-51.