肝癌是一种比较常见的恶性肿瘤,其发病率在癌症疾病中排名前5,致死率排肿瘤疾病的第3位[1]。当前治疗肝癌的手段主要是手术治疗和化疗,虽然治疗后能够延长患者的生存期,但存在肿瘤耐药性、副作用大和疗效差的问题[2]。从分子水平探讨肝癌的发病机制并寻找肝癌治疗的作用靶点是近年来研究的热点问题之一。长链非编码RNA(longnon-codingRNA,LncRNA)在转录、转录后、表观遗传等方面调控基因的表达,与肿瘤的发生、复发和转移密切相关[3,4,5]。SNHG6是近年来发现的一种LncRNA,研究显示,其在肝细胞癌组织中表达上调[6],可影响肝细胞癌细胞的增殖、凋亡等生物学行为[7]。但目前,SNHG6调控肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制尚不明确。生物信息学软件预测显示,miR-186是SNHG6的靶基因。研究显示,miR-186调控肝癌细胞E-cadherin表达,影响EMT的发生[8]。miR-186靶向YAP1蛋白表达抑制Hippo信号转导和肝癌的发生[9]。基于以上的研究,本研究通过检测肝癌患者癌组织及肝癌细胞中SNHG6和miR-186表达水平,探讨SNHG6对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其是否通过调控miR-186表达发挥作用,以期为肝癌的靶向分子治疗提供一定的理论依据。

1、材料与方法

1.1实验对象

自2013年7月至2014年6月郑州市中心医院确诊为肝癌的患者,临床样本共57例肝癌患者,所有患者未接受过放疗或化疗,其中男性31例、女性26例,年龄范围为28～76岁,中位年龄为56岁;肿瘤大小>3cm为40例,≤3cm为17例。采集肝癌组织以及配对的癌旁组织,癌旁组织取于距肿瘤病灶2cm以上的肝组织,放入液氮中保存。收集的标本的使用和研究获得本院伦理委员会批准,患者或家属自愿签署知情同意书。术后对所有患者进行上门或电话随访,随访时间为手术当日至死亡当日或随访截止日,随访截止日为2018年7月。

1.2实验材料与试剂

人正常肝细胞株L02与人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、Huh7和HCCLM3均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司;miR-186mimic、miR-con、anti-miR-186、anti-miR-con均购自美国Ambion公司;胎牛血清与RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司;MTT购自美国Sigma公司;Transwell小室购自Costar公司;Trizol试剂购自美国Ambion公司;实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Kapa公司;RNA反转录试剂盒购自美国GeneCopoeia公司;荧光素酶报告载体与荧光素酶活性检测试剂盒均购自美国Promega公司;十二烷基硫酸钠购自美国Amresco公司;细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抗体购自美国CST公司;细胞周期蛋白1(CyclinD1)抗体购自美国SantaCruz公司;MMP-2抗体、MMP-9抗体和β-actin抗体购自英国Abcam公司;兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体均购自美国Epitomics公司。

1.3细胞培养、细胞转染及分组

人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株(HepG2、SMMC-7721、Huh7、HCCLM3)均用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,置于37℃,5%CO2的培养箱中常规培养。收集对数生长期的HepG2细胞,用脂质体LipofectamineTM2000分别转染SNHG6的小干扰RNA(si-SNHG6组)、阴性无意义对照序列(si-con组)、SNHG6过表达载体(pcDNA3.1-SNHG6组)、空载体(pcDNA3.1组)、共转染si-SNHG6与anti-miR-186抑制剂(si-SNHG6+anti-miR-186组)、si-SNHG6与miR-186抑制物阴性对照(si-SNHG6+anti-miR-con组)。具体转染步骤参照Lipofectamine2000试剂盒说明书。转染6h后更换含有10%胎牛血清的DMEM培养基,放入恒温培养箱继续培养至48h。收集细胞,用于后续实验。

1.4RT-qPCR实验

用Trizol液裂解细胞,按RNA抽提试剂盒说明书操作提取RNA,进行定量,再用逆转录试剂盒按说明书操作合成cDNA。以cDNA为模板,进行PCR。扩增条件:94℃30s,64℃30s,72℃40s,共34个循环;72℃8min。SNHG6以β-actin为内参,miR-186以U6为内参,用2-△△Ct计算SNHG6和miR-186的相对表达水平。SNHG6引物:SNHG6-F:5'-CCTACTGACAACATCGACGTTGAAG-3',SNHG6-R:5'-GGAGAAAACGCTTAGCATACAG-3';β-actin引物:β-actin-F:5'-GGACCTGACTGACTACCTC-3',β-actin-R:5'-TACTCCTGCTTGCTGAT-3';miR-186和U6引物来源于实时荧光定量试剂盒。

1.5双荧光素酶报告基因检测实验

构建SNHG6野生型(WT)和突变型(MUT)质粒,分别将其与miR-186模拟物、阴性对照转染至HepG2细胞。转染48h后,收集细胞。用Trizol裂解液裂解,取5μl裂解液与萤火虫荧光素酶缓冲液和5μl底物,混匀测荧光强度。然后加入海肾荧光素酶缓冲液和5μl腔肠素底物,混匀,测得海肾荧光素酶活性。

1.6MTT实验

转染后的各组细胞,以每孔5×103个接种于96孔板中,分别培养24、48和72h后,加入20μlMTT(0.5g/L)溶液,继续培养4h,取出弃去上清,每孔加入150μlDMSO,震荡,使结晶充分溶解,在490nm波长下检测细胞吸光度(OD490)。

1.7Westernblot实验

用RIPA裂解细胞提取总蛋白,BCA法进行蛋白定量。取适量蛋白100℃煮沸5min,变性后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后,转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2h。然后分别加入CDK4(1∶1500)、CyclinD1(1∶1500)、MMP-2(1∶1500)、MMP-9(1∶1500)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶1000)、Vimentin(1∶1000)、β-actin(1∶3000)抗体,4℃孵育过夜。次日,洗膜后,再用辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2h。结束后加入显影液显影,凝胶成像系统曝光拍照。以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

1.8Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力

各组转染后的细胞,用不含血清的培养基混悬,调整浓度为5×104个/ml。细胞迁移实验:取100μl细胞悬液加入Transwell上室,下室加入600μl含血清的培养基。常规培养48h后,取出小室,用棉签擦去上室内的细胞,PBS洗涤3次,甲醇固定30min,0.1%结晶紫染色20min,PBS洗涤3次。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞,随机取3个视野拍照计数,取平均数。细胞侵袭实验:预先在小室上表面涂抹适量厚度基质胶,然后再加入100μl细胞悬液,后续操作步骤同细胞迁移实验。显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞数,随机选取3个视野拍照计数,取平均数。

1.9统计学处理

实验中所有数据均采用SPSS21.0软件进行分析。每组实验进行3个平行,重复两次。计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1SNHG6和miR-186在肝癌组织和肝癌细胞株中的表达

通过RT-qPCR检测肝癌患者癌组织和癌旁组织中SNHG6和miR-186的相对表达,结果如图1A-B所示,与癌旁组织相比,肝癌组织中SNHG6表达显著升高(t=5.436,P<0.05),miR-186表达显著降低(t=15.329,P<0.05),且两者存在负相关的表达关系(图1C)。进一步检测肝癌细胞系和正常肝细胞中SNHG6和miR-186的相对表达,结果如图1D-E所示,与正常肝细胞相比,肝癌细胞系中SNHG6显著高表达(F=64.789,P<0.05),miR-186显著低表达(F=63.499,P<0.05)。

图1SNHG6和miR-186在肝癌组织和肝癌细胞株中的相对表达

2.2SNHG6靶向调控miR-186的表达

运用DINAN预测到SNHG6与miR-186存在结合位点(图2A);双荧光素酶活性检测结果显示,与miR-con组相比,miR-186组SNHG6-WT细胞中荧光活性显著降低(t=12.775,P<0.05),SNHG6-MUT细胞中荧光活性不受影响(t=1.674,P>0.05)(图2B)。与si-con组相比,si-SNHG6组细胞中miR-186表达显著升高(图2C,t=10.957,P<0.05),与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1-SNHG6组细胞中miR-186表达显著降低(图2C,t=11.685,P<0.05)。

2.3改变SNHG6和miR-186表达量对肝癌细胞HepG2增殖的影响

在HepG2细胞中转染si-SNHG6,培养时间超过24h细胞活力明显下降(图3A,t48=5.645,t72=8.950,P<0.05),Westernblot检测转染si-SNHG648h后细胞增殖相关蛋白CDK4和CyclinD1表达降低(图3B-C,t1=12.229,t2=7.467,P<0.05);同时转染si-SNHG6和anti-miR-186,细胞活力相对转染si-SNHG6和anti-miR-con组有所恢复(图3A,t48=4.908,t72=4.426,P<0.05),增殖相关蛋白CDK4和CyclinD1表达有所提升(图3B-C,t1=11.636,t2=7.403,P<0.05)。

2.4改变SNHG6和miR-186表达量对肝癌细胞HepG2迁移和侵袭的影响

将si-SNHG6转染至HepG2细胞中检测细胞迁移和侵袭能力变化,结果表明:与si-con组相比,si-SNHG6组视野内迁移和侵袭细胞数明显减少(图4A-C,t1=22.289,t2=12.941,P<0.05),Westernblot检测转染si-SNHG648h后细胞迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9表达降低(图4D-E,t1=9.511,t2=6.341,P<0.05);同时转染si-SNHG6和anti-miR-186,视野内迁移和侵袭细胞数相对转染si-SNHG6和anti-miR-con组有所恢复(图4A-C,t1=4.908,t2=13.286,P<0.05),迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9表达有所提升(图4D-E,t1=8.256,t2=6.065,P<0.05)。

图2SNHG6靶向miR-186并调控其表达

图3转染anti-miR-186逆转沉默SNHG6对HepG2细胞增殖的抑制作用

2.5沉默SNHG6和降低miR-186表达量对肝癌细胞HepG2中EMT的影响

将si-SNHG6转染至HepG2细胞中检测细胞EMT的发生,结果表明:与si-con组相比,si-SNHG6组EMT相关蛋白E-cadherin表达增加(t=14.946,P<0.05),N-cadherin明显减少(t=7.247,P<0.05),Vimentin明显减少(t=5.435,P<0.05);同时转染si-SNHG6和anti-miR-186,EMT相关蛋白E-cadherin表达有所下降(t=8.948,P<0.05),N-cadherin(t=7.403,P<0.05)和Vimentin(t=4.556,P<0.05)表达有所提升,见图5。

3、讨论

肝癌是导致癌症患者死亡的第3大病因,其诊断、预后以及治疗方案的选择仍然有限[1]。LncRNA对肿瘤的调节作用已成为肿瘤研究的热点,对肝癌发病机制的研究以及发现新的肿瘤治疗靶点提供可能。Chang等[10]研究发现,SNHG6在肝癌患者肿瘤组织中相对癌旁组织高表达,并与患者预后呈负相关。本研究结果显示,肝癌组织中SNHG6表达明显高于癌旁组织,抑制SNHG6表达可有效抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力,与相关研究报道结果一致[4],说明SNHG6作为促癌基因参与肝癌的发生和发展,但其作用机制有待深入探讨。CyclinD1作为细胞周期的启动因子,可与CDK4结合促进细胞周期由G1期转化为S期从而促进细胞增殖[11]。MMP-2和MMP-9是一类基质金属蛋白酶,能够降解细胞外基质增加肿瘤的迁移和侵袭能力[12]。本研究结果显示,抑制SNHG6表达可降低肝癌细胞CDK4、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达。

图4转染anti-miR-186逆转沉默SNHG6对HepG2细胞迁移和侵袭的抑制作用(结晶紫染色×100)

图5沉默SNHG6和降低miR-186表达量对HepG2细胞EMT发生的影响

微小RNA(miRNA)属于非编码RNA分子家族,其通过翻译抑制或mRNA降解来调节基因表达,miR-186是miRNA家族成员之一,已有的研究发现,miR-186在卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌和肝癌等多种恶性肿瘤中表达相较于正常组织下调[13,14,15,16]。此外,miR-186可以直接靶向抑制非小细胞肺癌细胞周期蛋白D1(CCND1)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2和CDK6进而抑制细胞增殖和诱导细胞周期阻滞[17]。沉默PTTG1促进表皮生长因子(EGF)对非小细胞肺癌中MMP-2和MMP-9的促进作用,miR-186-5p靶向负调控PTTG1表达,对MMP-2和MMP-9表达具有一定的抑制作用[18]。本研究结果显示,miR-186在肝癌组织和细胞中表达降低,提示miR-186也参与肝癌的发生和发展;通过靶基因预测显示SNHG6的核苷酸序列与miR-186存在结合位点,双荧光素酶报告基因和RT-qPCR实验证实了SNHG6在肝癌细胞中靶向负调控miR-186表达。本研究还显示,肝癌组织中SNHG6与miR-186呈负相关,抑制miR-186表达逆转了抑制SNHG6表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白CDK4、CyclinD1、MMP-2和MMP-9的抑制作用,说明抑制SNHG6通过上调miR-186表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

癌细胞转移是癌症高死亡率的主要原因,EMT可促进多种癌细胞的转移,原因可能是发生EMT的癌细胞黏附能力降低,细胞转移能力提升,使癌细胞更易离开原组织,进行浸润或者血行和淋巴转移,定位到新的组织或器官[19]。上皮细胞中连接蛋白E-cadherin和间充质标志蛋白N-cadherin及Vimentin的表达与EMT发生关系密切[20]。研究显示,上调miR-186通过靶向ZEB1抑制结直肠癌细胞的增殖、转移和上皮间质转化[15]。本研究发现抑制SNHG6表达可显著增加E-cadherin表达,降低N-cadherin和Vimentin的表达;沉默SNHG6的基础上抑制miR-186表达比单独沉默SNHG6可降低E-cadherin表达,增加N-cadherin和Vimentin的表达,我们研究表明SNHG6可以通过miR-186的表达降低EMT进程影响肝癌细胞HepG2的转移。

综上,本研究发现肝癌组织和细胞中SNHG6表达升高,miR-186表达降低;抑制SNHG6表达可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,降低EMT进程,其机制可能与靶向负调控miR-186表达有关,为肝癌的靶向分子治疗提供新的方向。

参考文献：

[11]王稣佳,胡敏.蛋白激酶D抑制剂SD-208对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡的影响[J].临床肿瘤学杂志,2016,21(2):106-110.

[12]马鹏飞,阮柏,王德盛,等.黄芪甲苷对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制研究[J].现代肿瘤医学,2014,22(5):1012-1015.

杨鹏生,宋黎明,段希斌,梁马可,梁占强,李学民.LncRNASNHG6调控miR-186表达对肝癌细胞增殖､迁移和侵袭的影响及机制[J].现代肿瘤医学,2020,28(19):3319-3324.