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异补骨脂素对模拟微重力引起的骨质流失的防治作用

2024-11-20 18 上传者：管理员

摘要：目的研究异补骨脂素对模拟微重力导致小鼠骨质流失的治疗作用。方法将C57BL/6J小鼠随机分为5组：地面对照组(CON)、尾吊组(HU)、低剂量给药组(ISO-L)、中剂量给药组(ISO-M)、高剂量给药组(ISO-H),每组12只。给药21 d后，处死所有小鼠，取五脏、血清、股骨、胫骨，用于组织病理学检测、Mirco-CT成像分析、血清指标检测、股骨骨组织蛋白分析以及碱性磷酸酶阳性克隆染色。结果与CON组相比，HU组骨密度(bone mineral density, BMD)和骨小梁厚度(Tb.Th)均呈显著降低趋势(P<0.01),骨体积分数(BS/TV)、骨表面积密度(BV/TV%)明显降低(P<0.05),骨小梁数量(Tb.N)下降，骨小梁分离度(Tb.Sp)升高；与HU组相比，尾吊给药后BMD、BV/TV%、Tb.Th、BS/TV均显著升高(P<0.05),Tb.N升高，Tb.Sp下降，均以高剂量组效果最佳。与CON组相比，HU组血清中骨钙素(OCN)下降(P<0.01),抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)浓度上升(P<0.01);尾吊时给予异补骨脂素，使OCN升高(P<0.01),TRACP-5降低(P<0.01)。与CON组相比，HU组的OPG蛋白表达量降低(P<0.05),RANKL蛋白表达量升高(P<0.05),与HU组相比，给予异补骨脂素后OPG、蛋白表达量升高，RANKL的蛋白表达量降低(P<0.05)。HU组所显示的蓝紫色碱性磷酸酶染液颗粒与地面对照组相比密度低，颜色浅，尾吊时加入异补骨脂素后蓝紫色碱性磷酸酶染液颗粒密度升高。结论异补骨脂素能促进模拟微重力状态下骨形成同时抑制骨吸收有效防治骨质的流失。

关键词：
异补骨脂素
模拟微重力
骨矿物质
骨质流失
骨骼稳态
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随着太空探索的深入，微重力所带来的一系列症状引起了人们的关注，太空环境对宇航员的健康有严重威胁，其中由微重力诱发的骨质疏松症是主要问题之一[1]。对于宇航员来说，在太空中每月的骨质流失可达到1%～1.6%,相当于地球上骨质疏松症患者10年的骨质流失[2]。由于没有重力，太空飞行产生了一种独特的骨骼卸载条件导致骨矿物质迅速减少从而导致骨质疏松，并对骨骼稳态产生不利影响[3]。尾吊模型可以复制长时间卧床休息和空间微重力，是模拟微重力最常见的一种模型[4]。目前，关于治疗失重性骨丢失的药物只有维生素D、钙剂、维生素K及双膦酸盐类药物，且仍具有一定的不良反应[5]。中药可用于治疗骨质疏松，且疗效良好、毒副作用低，因此尝试从传统中药中寻找影响由微重力影响导致骨流失的有效药物。

异补骨脂素(Isopsoralen, ISO)为豆科植物中呋喃香豆素类提取物，是补肾中药补骨脂的主要有效活性成分之一[6]。ISO是补骨脂吸收进入血液的主要活性成分，也是补骨脂主要的毒性成分，作为一种天然植物雌激素，在维持骨代谢的稳态中起着重要作用。通过调节骨代谢信号通路，促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞分化增殖，抗炎症和氧化应激等途径，可改善骨代谢紊乱[7]。本实验通过建立尾吊小鼠模型创造模拟微重力环境，由模拟微重力影响导致的骨质流失通过异补骨脂素干预，研究小鼠骨小梁微结构的影响，进行骨相关蛋白、骨代谢血清指标等检测，为中药在空间环境如何有效治疗骨质流失提供实验依据，为航天事业更好发展做出贡献。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：

选用2月龄体质量在(23±2)g的C57BL/6J雄性小鼠60只，购自河南斯克贝斯生物科技公司，饲养于联勤保障部队第九四○医院SPF级动物实验中心。适应性饲养一周后开始实验，实验过程均符合3R原则。

1.1.2药品、主要试剂与仪器：

ISO,购于成都埃法生物科技有限公司(产品批号：AF21071801)纯度>98%;骨钙素(OCN)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)ELISA检测试剂盒，购于泉州睿信生物科技有限公司；碱性磷酸酶染色试剂盒，购于北京索莱宝科技有限公司(G1480);一抗：OPG、RANKL、GAPDH,购于美国Affinity公司，二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)、Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP),购于南京巴傲得生物科技有限公司；电泳仪和电转膜仪，购于美国Bio-Rad公司；Micro CT扫描仪器，购于平生医疗科技(昆山)有限公司(型号：NMC-100)。

1.2方法

1.2.1动物分组、给药及造模：

将经过7 d适应性饲养并测量体重的小鼠随机分为5组，每组12只，分别是地面对照组(CON)、尾吊组(HU)、低剂量药物组(ISO-L)、中等剂量药物组(ISO-M)以及高剂量药物组(ISO-H),所有小鼠均使用灌胃法给予药物，其中ISO-L组、ISO-M组、ISO-H组分别每天灌服10、20、40 mg/kg的ISO,CON组和HU组灌服等体积生理盐水，每日1次，3周后取材。将尾吊组和给药组的小鼠建立尾吊模型，在小鼠尾部2/3部位用医用胶带缠绕并放置轧带并固定，使小鼠头部始终朝下，后肢悬空不负重，且前肢能自由活动，可正常饮水摄食。

1.2.2脏器指数检测：

小鼠取材时，取出心、肝、脾、肺、肾，将周围多余组织剥除后放入4%多聚甲醛固定，脏器系数计算公式为：脏器系数=(脏器中量/小鼠体质量)×100%,后将各脏器放入组织固定液中进行固定，再将固定好的脏器进行包埋、切片与HE染色，显微镜检并采集图片分析。

1.2.3 MicroCT分析：

将待测的右侧股骨固定在4%的多聚甲醛中，每组6只。Micro CT扫描仪的参数设置：采集模式为DR扫描，触发方式为外部触发，管流为150μA,管压为70 kV,最大横向视野为15 mm, DSD为395 mm, DSO为26 mm, Rebin模式为2×2,帧频为30。使用软件扫描得到纵截面最大剖面图，选择骨骺线下1～1.5 mm处分析得到该区域松质骨的骨形态差异。

1.2.4血清骨代谢生化指标检测：

取材时，采用眼球采血法，每只小鼠取1.5 mL左右，设置4℃,3 000 r/min, 15 min离心，离心后取上层血清，分装后于-80℃冰箱保存。按照试剂盒说明书绘制标准曲线并计算出OCN、TRACP-5b的含量。

1.2.5骨形成与骨吸收相关蛋白OPG/RANKL检测：

将待测的左侧股骨-80℃保存，每组随机取6只。将骨组织置于生理盐水中并放在冰面上，剪去骨两端冲出骨髓，将髓腔冲洗干净后，放于离心管中剪碎，而后放入组织匀浆仪中研磨并加入高效组织蛋白裂解液，裂解30 min后，离心取上清，用BCA法测蛋白浓度，进行蛋白定量并加入上样缓冲液，沸水30 min至蛋白变性后于-20℃保存。按说明配置分离胶与浓缩胶，加入蛋白样品分离蛋白，在110 V电压进行电90 min,将蛋白转至PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉中封闭2 h,将蛋白条带放于1∶1 000稀释的抗体中，4℃孵育过夜，TBST缓冲液清洗后，二抗孵育2 h,清洗后进行曝光获取图像。

1.2.6骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶阳性克隆染色：

灌服21 d后，每组取一只小鼠，取左右两侧的股骨胫骨，剔除多余组织，配置完全培养基，剪去骨两端从断端冲洗骨髓腔至髓腔发白，将细胞混悬液冲打均匀后分装于培养基中进行培养。细胞融合90%后将培养液换为成骨诱导培养液(10%FBS、1×10-7mol/L地塞米松、1×10-2mol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/mL抗坏血酸)进行诱导，每3 d换一次培养液，诱导培养9 d后进行碱性磷酸酶染色。

1.3统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行处理。用表示，组间比较采用单因素方差分析，LSD检验，P<0.05表示差异具有统计学意义；使用Image-Pro Plus6.0进行图像量化，使用Origin(2022)绘图。

2、结果

2.1体质量及给药安全性分析

由表1可见，与CON组相比，HU组、ISO-L组、ISO-M组、ISO-H组体重呈显著下降趋势；由表2可见，脏器系数无明显变化；图1显示，脏器HE染色无明显病理变化。

表1实验前后小鼠体质量

表2各组小鼠脏器系数变化

2.2股骨Micro CT成像分析

股骨远端经Micro CT分析得到最大刨面图(见图2)。与CON组相比，HU组的松质骨密度明显更稀疏，给药后松质骨变致密，骨小梁数量也增多，骨小梁间距变小，骨小梁与骨小梁间的连续性与延展性变好；尾吊导致骨小梁间距增大，给药后间距减小(见图3)。如表3所示，与CON组比较，HU组BMD和Tb.Th均呈显著降低趋势(P<0.01),BS/TV、BV/TV%明显降低(P<0.05),Tb.N下降，Tb.Sp升高；与HU组相比尾吊给药后，BMD、BV/TV%、Tb.Th、BS/TV均显著升高(P<0.05),Tb.N升高，Tb.Sp下降，均以高剂量组效果最佳。

2.3血清骨代谢生化指标结果

如图4所示，尾吊后的血清中OCN含量与CON组相比始终呈显著下降趋势(P<0.01),尾吊时给予ISO后，缓解了OCN的下降趋势，且高剂量组恢复最为明显(P<0.01);尾吊使TRACP-5b显著上升(P<0.01),尾吊时给予ISO后，TRACP-5b显著降低(P<0.01)。

表3各组小鼠股骨骨小梁参数变化

图5各组小鼠OPG、RANKL蛋白表达水平

图1主要脏器病理学HE染色结果(×400)

图2各组小鼠股骨Micro CT最大刨面图

图3各组小鼠骨小梁3D重建图

图4各组小鼠血清生化指标比较

2.4骨形成与骨吸收相关蛋白表达情况

如图5所示，与CON组相比，模拟微重力导致骨形成蛋白OPG的表达量明显降低(P<0.05),骨吸收蛋白RANKL的表达量明显升高(P<0.05);与HU组比较，给药组OPG蛋白表达量升高无显著差异，RANKL蛋白表达量降低，其中ISO-H组RANKL蛋白表达量明显下降(P<0.05)。

2.5碱性磷酸酶阳性克隆染色结果

由图6可知，HU组所显示的蓝紫色碱性磷酸酶染液颗粒与CON组相比密度低，颜色浅，有显著的统计学差异(P<0.01),尾吊时加入ISO后蓝紫色碱性磷酸酶染液颗粒密度升高，有显著统计学差异(P<0.01)。

图6各组小鼠碱性磷酸酶染色结果

3、讨论

自从人类开始探索太空，随着宇航员在太空停留的时间越来越长，微重力引起人体的变化和健康问题，如心血管、免疫或肌肉骨骼等也引起了重视，其中失重导致的骨丢失是人类关注的重大问题之一[8],太空失重影响宇航员面临骨骼流失导致骨质疏松的问题，影响了航天事业进一步发展[9]。《素问·痿论》曰：“肾者水藏也……则骨枯而髓虚……发为骨痿。”又曰“肾气热……骨枯而髓减，发为骨痿。”说明肾中之精气的盛衰决定了骨骼生长发育的强健或软弱[10]。补骨脂，补肾壮阳，现代药理研究发现有抗骨质疏松症、抗癌症、治疗银屑病等药理作用，ISO是补骨脂发挥多种药理作用的重要活性成分之一[11]。目前关于ISO防治微重力环境引发的骨丢失，未有相关报告提供有力证据。为探究该问题，本研究进行了尾吊模拟太空微重力环境中骨质流失的实验，并针对该情况，探究了ISO在微重力环境诱发骨质疏松症中的作用。

Micro CT量化结果显示，10、20、40 mg/kg的ISO均能缓解由尾吊引起骨微的结构的破坏，增加了Tb.BMD、BV/TV%、BS/TV、Tb.N以及Tb.Th,减小了Tb.Sp,并且高剂量组效果最为明显，证明ISO能改善尾吊所致骨微结构的破坏。血清骨代谢生化指标作为骨转换率的直接反映指标，OCN反映体内骨形成骨吸收指标，TRACP-5b反映体内骨吸收状态，前者由成骨细胞分泌的低分子酸性蛋白质，后者由破骨细胞产生的反映破骨细胞活性的物质[12-13];本实验检测结果显示，尾吊小鼠血清中OCN显著降低，TRACP-5b显著升高，给药后OCN明显升高，而TRACP-5b降低，高剂量组效果最佳，表示异补骨脂素可缓解由尾吊导致的骨质流失，促进成骨细胞分泌，同时抑制破骨细胞形成。核因子κB配体受体激活剂(RANKL)介导破骨细胞生成，是一种膜相关细胞因子，骨保护素(OPG)是一种可溶性RANKL诱饵受体，主要由成骨细胞产生，通过抑制RANKL-RANKL受体相互作用来防止破骨细胞形成和破骨细胞骨吸收[14-15];Western blot检测结果显示，尾吊会使OPG蛋白表达量降低，RANKL蛋白表达量升高，加入ISO后OPG蛋白表达量升高，RANKL的蛋白表达量降低，高剂量效果最佳，说明异补骨脂素具有促进骨形成蛋白表达，抑制骨吸收蛋白表达从而抑制由模拟微重力导致的骨质流失。碱性磷酸酶阳性克隆染色结果显示，HU组所示的蓝紫色碱性磷酸酶染液颗粒与CON组相比密度低，颜色浅，尾吊时加入ISO后蓝紫色碱性磷酸酶染液颗粒密度升高，表明ISO能抑制尾吊导致的成骨细胞分化成熟能力下降的现象。

综上所述，本实验结果初步显示，ISO可改善骨微结构并参与骨形成和骨吸收，从而改善由尾吊导致的骨流失。本实验未涉及细胞实验，其作用机制尚不明确，后续会进一步深入研究为人类能更好探索太空提供解决方案，为航天事业更好发展作出贡献。

参考文献:

[5]袁国栋,李玉恒,凌树宽,等.失重性骨丢失的药物防护综述[J].载人航天,2021,27(3):298-304.

[6]刘雨昕,孟明星,周茜,等.异补骨脂素调节骨代谢的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(11):1674-1677.

[9]刘菁,冷非凡,高玉海,等.太空微重力环境诱导骨丢失的研究进展[J].解放军医药杂志,2021,33(3):112-116.

[10]李振文,袁德培,曾楚华,等.基于“肾主骨”探析中医药治疗骨质疏松症[J].湖北民族学院学报(医学版),2017,34(2):65-68.

[12]陈德才,廖二元,徐苓,等.骨代谢生化标志物临床应用指南[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2015,8(4):283-293.

[13]朱玲.骨代谢生化标志物临床应用指南[J].系统医学,2017,2(15):7-9.

[14]熊燕,何朝霞,颜永强,等.基于OPG/RANKL探讨地诺单抗对老年性骨质疏松大鼠血管钙化的作用机制[J].中国老年学杂志,2022,42(20):5081-5085.

基金资助:中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院实验室培育项目(2021yxky081);甘肃省自然科学基金(22JR11RA013);兰州市科技计划项目(2023-1-8);

文章来源:唐汉琴,李亮,轩莹莹,等.异补骨脂素对模拟微重力引起的骨质流失的防治作用[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(11):1612-1616+1632.