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甲状腺激素T3对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏细胞增殖与凋亡影响

2024-12-18 26 上传者：管理员

摘要：目的研究甲状腺激素T3对急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏结构与功能的影响及细胞增殖与凋亡的相关基因表达。方法对正常小鼠提前给予不同浓度的甲状腺激素T3腹腔注射干预，最后一次给药后给予50%酒精溶液一次性灌胃，24 h后处死，并留取血清和肝脏。该实验通过建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，对甲状腺激素T3在其中的作用进行分析。结果经T3干预后的急性酒精性肝损伤小鼠可观察到肝小叶轮廓清晰，肝索排列较为整齐，但存在炎细胞浸润，血清ALT活性和肝脏ROS含量增加，高剂量组PCNA表达增加(P<0.05),凋亡基因Caspase3和Bax表达较模型组有所降低(P<0.01),但随T3干预浓度升高凋亡基因表达出现上升趋势。结论浓度较高的甲状腺激素T3干预，会使小鼠急性酒精性肝损伤加重。

关键词：
急性酒精性肝损伤
生物合成
甲状腺激素T3
细胞增殖与凋亡
肝脏
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肝脏是人体最大的实质性器官，担负着消化、解毒、分泌及生物合成等功能[1]。大量饮酒所导致的肝脏疾病表现被称为酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD),急性酒精性肝损伤是指在短时间内过量饮酒所导致的急性肝脏疾病综合征，可以表现为恶心、呕吐、厌油、尿黄、腹胀、肝区不适的症状。当出现一定程度的重症肝炎倾向时，临床症状表现更为明显，患者极度疲劳，出现腹胀、黄疸，此外还可出现腹水、意识障碍、出血等临床表现，严重危害患者的生命。目前对急性酒精性肝损伤的相关研究还比较缺乏，临床预后较差。因此，关于急性酒精性肝损伤的相关研究成为近年来广泛关注肝脏相关疾病的研究重点[2-6]。甲状腺激素是甲状腺分泌的激素，它的生理作用几乎涉及身体的每一个器官，能促进物质的能量代谢，刺激细胞促进细胞分化，调节造血和急性期蛋白系统，调节神经和内分泌系统，调节骨骼和心血管系统等多种生物功能。体内甲状腺激素水平的失衡可能导致肝脏疾病[7-9]。研究表明，甲状腺功能减退与ALD的患病风险显著相关，目前尚无详细报道甲状腺激素与ALD的研究，本研究将通过建立急性酒精性肝损伤模型，对甲状腺激素在肝损伤中的作用进行研究。

1、材料与方法

1.1动物

健康的雄性SPF级6～8周龄C57BL/6N小鼠，体质量为(22±2)g,来源于北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号：SCXK(京)2016-0006]。实验小鼠在河南科技大学基础医学与法医学院的兽舍内进行喂养，每天昏暗、光照各12 h。动物实验全部通过河南科技大学附属第一医院实验动物伦理委员会审核(批准号：HAUST-024-M1113001)。

1.2试剂

3,3’,5-三碘代-L-甲状腺原氨酸(分析纯度≥95%,美国Sigma有限公司，T2877)。ALT检测试剂盒购自南京建成(CB10400-Hu)。ROS-ELISA检测试剂盒购自钰博生物(YB18-0120)。HE染色试剂盒购自Biosharp(BL700A)。ECL化学发光底物试剂盒购自Biosharp(BL520A)。30% Acr-Bis(29∶1)购自Biosharp(BL513B)。1 mol/L Tris-HCl pH 6.8购自Biosharp(BL514A)。1 mol/L Tris-HCl pH 8.8购自Biosharp(BL515A)。

1.3实验仪器

组织切片机Leica RM2128购自德国徕卡有限公司，酶标仪购自美国BioTek公司，JY300c电泳仪和JY-SCZ2电泳槽购自北京君意东方电泳设备有限公司，低温高速离心机购自美国Thermo公司，MILL-Q Biocel超纯水系统购自美国MILLIPORE公司。

1.4动物分组及急性酒精性肝损伤模型建立

首先，选择35只C57BL/6N小鼠，6～8周龄，(22±2)g进行随机分组，共5组，每组7只，分别为对照组、急性酒精性肝损伤组(以下称为模型组)以及低、中、高三个浓度的T3干预组。然后，将每天腹腔注射生理盐水一次的正常小鼠作为对照组；模型组也腹腔注射生理盐水每天1次；其余三组分别给予腹腔注射低剂量T3(25μg/kg)、中剂量T3(50μg/kg)、高剂量T3(100μg/kg)作为T3干预组。持续7 d后，给予对照组小鼠灌胃等体积蒸馏水，其余四组小鼠给予一次性50%酒精灌胃(24 mL/kg),禁食不禁水24 h后处死小鼠建立模型。

1.5血清ALT活性及甲状腺激素水平检测

小鼠眼球取血后，全血在室温下静置30 min,然后将血标本置于离心机中，设置为2 000 r/min, 4℃离心20 min,离心完成后收集上层的血清置于-20℃冰箱中保存备用。将处理好的血清标本严格按照试剂的说明书检测ALT活性，以及循环甲状腺激素TT3及TT4含量。

1.6 HE染色观察小鼠肝脏病理变化

解剖所得完整的肝叶于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,自来水冲洗，常规脱水透明后，浸蜡后制成石蜡切片。将4μm厚的石蜡组织切片，经常规脱蜡水化后，用苏木素溶液避光染色7 min,流水冲洗后用1%盐酸溶液进行分化，水洗后用伊红染色2 min,流水冲洗后在镜下观察染色效果，用酒精进行组织脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，备用。光镜观察小鼠肝脏病理变化情况，并拍照留念。

1.7肝匀浆ROS水平测定

取0.1 g新鲜肝脏组织，加入1 mL预冷PBS制备10%肝匀浆，根据试剂盒说明书要求操作实验过程，采用ELISA检测各组小鼠肝脏组织中ROS水平。

1.8蛋白免疫印迹法检测肝组织中PCNA、Caspase3、Bax蛋白表达情况

取0.1 g小鼠新鲜的肝组织，加入1 mL预冷的组织裂解液研磨至匀浆，12 000 r/min低温离心20 min,收集上清并分装，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，置于-80℃冻存。通过SDS-PAGE恒压蛋白电泳将所得组织蛋白进行分离，经质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉封闭及抗体孵育后，使用ECL化学发光法进行蛋白条带曝光，通过成像分析仪扫描即可观察到目标蛋白条带。使用ImageJ软件进行条带灰度分析，以β-actin作为内参蛋白比较各组小鼠肝组织中PCNA、Caspase3以及Bax蛋白表达情况。

1.9统计学分析

采用SPSS 21.0软件及Prism9做图并进行统计分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析(ANOVA)比较各组差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 T3干预对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏结构及功能的影响

观察图1中各组实验鼠肝脏HE染色结果，对照组实验鼠肝脏结构肝细胞结构清楚，肝索排列整齐，血窦宽窄适宜。与对照组相比，模型组的小鼠肝细胞增大，肝血窦变窄，肝细胞排列更加整齐。与模型组相比，T3干预组小鼠肝脏出现不同程度的脂肪空泡和炎性细胞浸润，肝细胞出现部分溶解，高剂量的T3干预组小鼠甚至出现少量的核质分离现象，肝脏损伤程度随T3干预浓度增高而加重；但经镜下观察，在T3干预组中，小鼠肝脏出现双核肝细胞，提示自我修复肝脏细胞。

同时检测了血清中ALT的活性初步判断各组小鼠的肝脏功能状态(见图2)。与对照组相比，模型组ALT活性显著增加；与模型组相比，T3干预组小鼠血清ALT活性进一步上升，其肝功能损伤程度明显大于模型组，且随T3干预浓度变化而变化。

图1各组小鼠肝脏HE染色结果(放大200倍)

图2血清ALT活性检测结果

2.2各组小鼠血清甲状腺激素水平变化

采用ELISA方法检测各组小鼠血清中甲状腺激素TT3及TT4水平。与对照组相比，模型组循环TT3水平下降，TT4水平上升。与模型组相比，T3干预组小鼠的循环TT3、TT4水平均上升，且随T3干预浓度升高而升高(见表1)。

表1循环甲状腺激素TT3、TT4水平检测结果

2.3各组小鼠肝脏组织中ROS含量检测

小鼠肝脏组织ROS检测结果见图3。与对照组相比，模型组肝脏组织中ROS含量增加；与模型组相比，T3干预组小鼠肝脏中ROS含量进一步增加，且随T3干预浓度升高而升高。

图3肝脏匀浆中ROS含量检测结果

2.4小鼠肝脏组织中细胞增殖及凋亡基因表达的情况

通过蛋白免疫印迹法检测肝组织中PCNA、Caspase3及Bax的表达，分析比较各组小鼠肝脏细胞增殖及凋亡的情况(见图4)。结果显示，与对照组比较，模型组的PCNA、Caspase3和Bax蛋白均表达上升(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比，低剂量T3干预组PCNA、Caspase3和Bax蛋白表达均出现下降(P<0.01),但PCNA表达下降差异无统计学意义；随着T3干预浓度的升高，PCNA、Caspase3和Bax蛋白表达均随之增加。

图4肝脏组织中PCNA、Caspase3、Bax表达情况

3、讨论

ALD是由于长期大量饮酒引起的，大量饮酒会引起肝细胞广泛坏死，严重者会出现肝衰竭。在ALD的初期阶段，急性酒精性肝损伤可以表现为恶心、呕吐、厌油、尿黄、腹胀、肝区不适的症状。当出现一定程度的重症肝炎倾向时，临床症状更加明显，患者极度疲劳、腹胀、黄疸。此外，还可有腹水、肝脑病变、出血等临床表现。急性酒精性肝损伤目前尚无具体的治疗方法，在这样的背景下，我们亟需从新的角度探讨急性酒精性肝损伤的诊治思路。T3在药物性肝损伤以及非酒精性脂肪性肝病的治疗中发挥重要作用[10-11],但T3在ALD中的作用未见研究。本研究以此为切入点，建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，探讨外源性T3在急性酒精性肝损伤中的作用，以期为早期诊断和治疗ALD提供新方法。

ALD发病机理复杂，一般认为是多个过程相互作用的结果，如乙醇直接肝毒性、脂质过氧化反应加剧、炎症因子大量释放和肝细胞过度凋亡等。其中，过度氧化应激被认为是其重要机制之一，DNA和蛋白质结构修饰在氧化应激条件下可导致多种疾病。各种抗氧化剂的特异性基因表达和信号传导途径在氧化应激时被激活，以维持体内平衡，使器官免受氧化损害受损害。肝脏比其他器官更容易受到氧化条件的影响[12]。

这一研究结果表明，外源性T3干预组的小鼠肝脏显微结构和功能出现损害程度随T3摄入水平变化，肝脏组织中ROS水平升高，说明甲状腺激素的干预使小鼠急性酒精性肝损伤和氧化应激程度加重，可能与T3进入体内后促进肝脏代谢有关。T3的增加可以促进机体的新陈代谢，从而在短期内造成肝细胞能量的过度消耗，当我们在这种情况下再对小鼠进行一次性酒精溶液灌胃，建立急性酒精性肝损伤模型，就会进一步加重肝脏的损伤程度。肝脏的损伤又影响到T4脱碘生成T3的过程，使循环血液中TT4的水平升高。此外，肝脏在酒精刺激下发生应激反应，细胞内ROS和抗氧化基因的生成不平衡，过多的活性氧生成超过固有的抗氧化防御机制时，ROS的蓄积会造成生物分子的广泛破坏，导致细胞受损，功能丧失。

免疫蛋白印迹法发现，模型组的小鼠肝组织中PCNA表达增多，同时细胞凋亡相关蛋白Caspase3和Bax表达也在增加，这说明酒精的一次性大量摄入引起了肝脏细胞的凋亡，但由于肝脏自身强大的自我修复能力，酒精刺激引起肝脏组织代偿反应，导致组织中PCNA蛋白表达增多。酒精损害造成肝细胞凋亡增多，肝脏进入代偿期，使机体通过细胞增殖而保持正常功能；考虑到T3本身对机体代谢的促进作用，低浓度T3的摄入促进了机体的细胞增殖，在一定程度上减少了细胞凋亡，但随着T3干预浓度的增加，导致肝脏产生过度代谢，加以酒精刺激，反而进一步促进了肝脏的损伤，可能由于目前选择的T3干预浓度尚未超出肝脏代偿能力范围，因此，高浓度T3干预组细胞增殖与凋亡基因表达均出现高于模型组的现象。

研究发现，提前对小鼠进行高浓度外源性T3干预，会加重小鼠急性酒精性肝损伤的程度。

参考文献:

[7]郑明云,何雅军,刘序友,等.肝硬化与甲状腺激素的相关性研究进展[J].中华肝脏病杂志,2022,30(3):331-334.

[10]陈怡.甲状腺激素与非酒精性脂肪性肝病研究进展[J].实用肝脏病杂志,2023,26(1):145-148.

基金资助:国家自然基金资助项目(82170606);河南省高等学校重点科研项目计划基础研究专项(23ZX006);

文章来源:孙枫林,罗仁利,冯家阳,等.甲状腺激素T3对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏细胞增殖与凋亡的影响[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(12):1661-1664.