急性缺血性脑卒中(AIS)是各种原因导致的脑组织血液供应障碍，占所有脑卒中类型的70%～80%[1]。近年来随着我国人口老龄化，AIS的发病率有逐渐升高的趋势[2]。AIS一旦发生，疾病快速进展，不仅能够导致神经功能损伤[3],还会引起患者血管性认知功能障碍(VCI),严重影响患者生活质量及寿命，为家庭带来严重经济负担。深入研究AIS的疾病机制，寻找能够评估AIS神经功能障碍及认知功能障碍程度的血清标志物，对于改善AIS患者预后，具有重要临床意义。环状RNA(CircRNA)是一种非编码RNA,是由mRNA前体反向剪接形成的闭环结构，具有高度保守性和稳定性，参与调节突触功能和神经可塑性的调节，与脑卒中、阿尔兹海默病等神经系统疾病关系密切[4,5]。近年来有学者对AIS患者的缺血脑组织进行高通量二代测序，发现CircOGDH、CircHECTD1等CircRNA存在异常表达上调的现象，推测其是新的AIS生物标志物[6,7]。本研究通过检测AIS患者血浆CircOGDH、CircHECTD1的表达，探讨二者与VCI及神经功能障碍的关系及临床预后意义。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2020年12月至2022年12月本院收治的112例AIS患者作为AIS组。纳入标准：(1)结合患者症状和体征，通过头颅CT或MRI检查确诊为AIS,并符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[8];(2)首次急性发病，发病时间<72 h; (3)临床资料完整，患者及家属已签署知情同意书；(4)发病前认知功能正常、行为功能正常。排除标准：(1)合并颅脑恶性肿瘤、脑外伤及心源性栓塞引起的脑卒中等；(2)合并精神病史或应用如胆碱酯酶抑制剂等影响认知功能的药物；(3)合并严重躯体疾病如心、肝、肾功能不全或重症感染、自身免疫性疾病；(4)静脉溶栓或动脉取栓。AIS组中，男70例，女42例；年龄31～80岁，平均(64.25±7.45)岁；体质量指数(BMI)平均(22.52±2.31)kg/m2;有高血压史52例；有糖尿病史23例；有吸烟史55例；梗死面积平均(3.57±1.14)cm2。选取同期体检的健康者60例为对照组，男34例，女26例；年龄32～79岁，平均(63.76±7.11)岁；BMI平均(22.46±2.29)kg/m2;有高血压史26例；有糖尿病史10例；有吸烟史29例。AIS组和对照组性别、年龄，BMI,高血压史、糖尿病史及吸烟史比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准通过。

1.2方法

1.2.1资料收集

收集性别、年龄、身高、体质量，计算BMI(BMI=体质量/身高2)、高血压史、糖尿病史等一般资料。根据AIS患者入院72 h内头颅MRI平扫+弥散成像结果，测量梗死面积。记录AIS患者入院后次日的实验室检查结果，指标包括血总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平。在AIS患者入院24 h内，进行美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)[9]评分，评分范围为0～45分，分值越高，提示AIS患者神经功能障碍越严重。

1.2.2血浆CircOGDH、CircHECTD1检测

采用实时荧光定量PCR反应检测。留取对照组体检时，AIS组入院第2日清晨空腹静脉血约5 mL,至于含EDTA-K2的抗凝管中，2 500 r/min离心15 min,分离上层血浆待测。利用总RNA提取试剂盒(购自北京索莱宝生物科技公司，货号R1200)提取血浆中总RNA,逆转录为cDNA后进行荧光定量PCR反应(通用逆转录试剂盒及2×SYBR Green PCR Mastermix试剂盒均购自北京索莱宝生物科技公司，货号RP1105、SR1110)。实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，型号ABI7500。反应条件为：95℃预变性5 min, 1个循环，95℃10 s, 60℃30 s,共40个循环。总体系20μL,其中cDNA 2μL,正反向引物各0.5μL,2×SYBR green Master Mix 10μL,无酶水7μL。引物由华大公司设计合成，引物序列：CircOGDH正向引物(5′-CCATCTGAAGCTTGGCAAACT-3′)、反向引物(5′-TTC AACTCTCTTCCAGTCAATCT-3′);CircHECTD1正向引物(5′-ATTGCTCTCCTTGCACCTGA-3′)、反向引物(5′-TCGCATGGATACAATGAATGGC-3′);内参GAPDH正向引物(5′-CCATTCTCGACTGTTTGCAGG-3′)、反向引物(5′-GACAGGAGTGCTCTGTAGGC-3′)。采用2-ΔΔCt法表示血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平。

1.2.3随访

AIS患者出院后3个月时门诊随访，由专业神经内科医生评估患者认知功能，并进行简易智能状态量表(MMSE)评分和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分。MMSE评分和MoCA评分范围均为0～30分，分值越低认知功能越差。同时根据《2019年中国血管性认知障碍诊治指南》[10],将AIS组患者分为VCI组(60例)和非VCI组(52例)。根据改良Rankin量表评估神经功能恢复情况[11],评分范围为0～5分，分值越高预后越差。根据该评分，将AIS组患者分为预后不良组(评分>2分，25例)和预后良好组(评分≤2分，87例)。

1.3统计学处理

采用SPSS26.0软件进行数据处理及统计学分析。经K-S检验符合正态分布的计量资料以

表示，组间比较采用t检验。计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析AIS患者血浆CircOGDH、CircHECTD1与临床指标的相关性。采用多因素Logistics回归分析影响AIS患者预后不良的因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血浆CircOGDH、CircHECTD1对AIS患者预后不良的评估价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1各组血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平比较

AIS组血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平分别为(2.58±0.54)、(2.17±0.36),对照组血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平分别为(0.84±0.25)、(0.66±0.24),AIS组血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平均高于对照组(t=23.616、29.181,P<0.001)。VCI组血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平分别为(3.11±0.51)、(2.98±0.32),非VCI组血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平分别为(1.83±0.56)、(1.15±0.38),VCI组血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平均高于非VCI组(t=12.657、27.667,P<0.001)。

2.2影响AIS患者预后不良的因素分析

相比于预后良好组，预后不良组梗死面积、入院24 h NIHSS评分，血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平较高，而出院3个月MMSE评分及MoCA评分均较低(P<0.05)。见表1。

表1影响AIS患者预后不良的因素分析(n/n或

2.3 AIS患者血浆CircOGDH、CircHECTD1与临床指标的相关性

Pearson相关分析结果，AIS患者血浆CircOGDH、CircHECTD1与梗死面积、入院24 h NIHSS评分呈正相关，与出院3个月MMSE评分，MoCA评分呈负相关(均P<0.05)。AIS患者血浆CircOGDH与CircHECTD1呈正相关(r=0.667,P<0.001)。见表2。

表2 AIS患者血浆CircOGDH、CircHECTD1与 临床评分的相关性

2.4多因素Logistic回归分析影响AIS患者预后不良的因素

以AIS患者出院3个月后的预后情况为因变量(预后不良=1,预后良好=0),以血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平、梗死面积、入院24 h NIHSS评分、出院3个月MMSE评分及MoCA评分为自变量，进行多因素Logistic回归分析，并采用逐步后退法(α进=0.05、α退=0.10)。结果显示，CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平升高及梗死面积较大、入院24 h NIHSS评分较高均是影响AIS患者预后不良的独立危险因素(均P<0.05),见表3。

2.5血浆CircOGDH、CircHECTD1对AIS预后不良的评估价值

血浆CircOGDH、CircHECTD1联合预测采用Log P模型，即基于前述Logistic回归结果，构建该两因子联合应用的回归预测模型，以模型值Ln(P/1-P)=0.283×CircOGDH+0.347×CircHECTD1为联合应用的虚拟概率量指标进行ROC曲线分析，ROC曲线结果显示，血浆CircOGDH、CircHECTD1联合预测AIS预后不良的曲线下面积为0.903(95%CI:0.852～0.955),明显大于单一指标的0.831(95%CI:0.781～0.866)、0.836(95%CI:0.794～0.870)(Z=2.258、2.119,P=0.021、0.031)。见表4、图1。

图1 ROC曲线分析血浆CircOGDH、CircHECTD1对AIS预后不良的评估价值  

表3影响AIS患者预后不良的多因素Logistic回归分析

表4血浆CircOGDH、CircHECTD1对AIS预后不良的评估价值

3、讨 论

脑卒中是中老年人群常见脑血管疾病。近年来随着人口老龄化加剧及人们生活工作压力的增强，脑卒中发病率呈逐渐升高的趋势[12]。AIS是最常见的脑卒中类型，患者不仅会遗留不同程度的偏瘫、肢体麻木及吞咽异常等神经功能缺失的症状，还会出现记忆力下降、言语功能障碍等认知功能障碍的表现[1]。深入研究AIS疾病机制，寻找能够评估AIS患者神经功能及认知功能障碍的血清标志物，对于早期积极诊治、改善患者的临床预后具有重要的临床意义。

CircRNA是不具有5′端帽和3′端多聚腺苷酸尾的环状非编码RNA,在大脑组织中高度富集，参与血管生成、自噬、凋亡及炎症等生理病理过程。相比于其他非编码RNA,CircRNA在外周血中更为稳定，不易降解，并具有较高的保守性[13]。有学者在大脑动脉闭塞动物模型中发现，梗死区域脑组织中CircRNA表达谱发生明显变化，影响脑损伤后病理变化及功能康复，是潜在的AIS生物标志物[14]。本研究中，AIS患者血浆CircOGDH表达上调，这与既往在脑梗死组织中发现的CircOGDH表达上调的研究结果一致[14]。AIS中CircOGDH的表达受缺氧诱导因子1表达的调控。研究表明，脑组织缺血缺氧能上调缺血组织中缺氧诱导因子1的表达，缺氧诱导因子1能结合MBL等RNA结合蛋白基因的缺氧反应原件，上调MBL表达，MBL能促进OGDH基因内含子序列桥接环化，导致CircOGDH表达增加[15]。本研究中，AIS患者血浆CircOGDH相对表达水平与神经功能障碍严重程度有关，提示CircOGDH参与促进AIS疾病的发展。有学者在AIS动物模型中发现，CircOGDH能够作为分子海绵结合抑制微小RNA-5112的表达，增加Ⅳ型胶原蛋白α4链mRNA的稳定性，促进脑组织中Ⅳ型胶原蛋白α4链蛋白的过度表达，大量未折叠蛋白导致神经元内质网应激，促进神经元细胞凋亡及神经功能障碍的发生，而敲除CircOGDH后，神经元细胞在缺血条件下的细胞存活能力显著增强，细胞凋亡减少，神经功能障碍也显著减轻[6]。本研究中，AIS患者血浆CircOGDH相对表达水平与MMSE评分、MoCA评分呈负相关，且VCI组AIS患者血浆CircOGDH相对表达水平明显升高，提示CircOGDH参与AIS患者认知功能障碍的疾病进展。分析其原因，AIS中神经元细胞分泌产生的CircOGDH能够促进海马中小胶质细胞细胞的活化，小胶质细胞分泌产生白细胞介素1β、白细胞介素6等促炎细胞因子，加重海马神经元的氧化应激损伤及细胞凋亡，引起认知功能障碍的发生[6,16]。本研究中，血浆CircOGDH相对表达水平升高是影响AIS患者预后不良的独立危险因素，提示检测血浆CircOGDH表达有助于评估AIS患者预后。研究发现，血浆CircOGDH的表达水平与大脑动脉闭塞小鼠模型脑梗死灶周围缺血半影区的面积呈正相关[6],因而对于血浆CircOGDH相对表达水平较高的AIS患者予以积极溶栓治疗，可能有助于改善缺血半影区，从而改善AIS患者临床预后。

CircHECTD1是由HECTD1基因的23外显子和24外显子编码产生的CircRNA,能够调节细胞自噬，参与冠状动脉粥样硬化性心脏病等疾病的发生[17]。本研究中，AIS患者血浆CircHECTD1相对表达水平升高，这与既往在短暂性大脑动脉闭塞小鼠卒中模型中缺血脑组织中的CircHECTD1相对表达水平升高的结果一致[7]。有研究报道，冠状动脉疾病患者平滑肌细胞中的CircHECTD1的N6-甲基腺苷修饰明显增加，导致CircHECTD1稳定性增加，进而导致血浆CircHECTD1水平升高[17]。此外，血浆CircHECTD1相对表达水平与AIS患者脑梗死面积及急性生理与慢性健康状况评分Ⅱ评分呈正相关，提示CircHECTD1参与AIS疾病的进展。有研究发现，CircHECTD1作为内源性竞争性RNA,结合并抑制微小RNA-142的活性，进而抑制TCDD诱导型聚ADP核糖聚合酶的表达，进而导致星形胶质细胞的过度激活，加重神经元损伤[7]。此外，在脑缺血缺氧/再灌注动物模型中，CircHECTD1可以通过结合微小RNA-27a-3p,促进卵泡抑素样蛋白1的表达，进而促进神经元凋亡的发生，加重神经功能障碍的程度[18]。本研究中，AIS患者血浆CircHECTD1相对表达水平与MMSE评分、MoCA评分呈负相关，且VCI组AIS患者血浆CircHECTD1相对表达水平升高更为明显，提示CircHECTD1参与AIS患者认知功能障碍的发生及进展。分析其原因，CircHECTD1表达上调能够激活转化生长因子β信号通路，促进小胶质细胞的活化，小胶质细胞释放大量促炎细胞因子，造成神经元氧化应激损伤，促进VCI和抑郁症的发生[19,20]。此外，CircHECTD1还能够加重缺血再灌注损伤过程中炎症反应，促炎细胞因子抑制海马中脑源性神经营养因子的表达，导致海马神经元的增殖、分化障碍且神经元完整性丧失，引起认知功能障碍的发生[21,22]。本研究中，血浆CircHECTD1相对表达水平升高是影响AIS患者预后不良的独立危险因素，表明血浆CircHECTD1可能是新的评估AIS患者预后的生物标志物。有学者发现，CircHECTD1敲低能够上调微小RNA-133b的表达，抑制肿瘤坏死因子受体相关因子3的表达，减小脑梗死小鼠模型中脑梗死灶体积，抑制神经元凋亡，改善神经功能损伤程度[23]。本研究利用ROC曲线分析发现，血浆CircOGDH、CircHECTD1联合检测对AIS的预后不良具有较高的评估价值，灵敏度和特异度分别为0.913、0.750,表明两项联合检测有助于评估AIS患者的临床预后，值得临床深入研究。

综上所述，AIS患者血浆CircOGDH、CircHECTD1相对表达水平升高，二者的表达与患者VCI及神经功能障碍程度有关，是影响AIS患者预后不良的独立危险因素。血浆CircOGDH、CircHECTD1联合检测对AIS预后不良具有较高的评估价值，有利于辅助临床医生对AIS患者积极诊治，以改善患者预后。但本研究样本量有限，未对AIS患者病程中血浆CircOGDH、CircHECTD1表达的动态变化进行监测，有待今后扩大样本量进行深入的临床研究。

参考文献:

[2]吴琼,王晨冉,赵燕,等.1990-2019年中国卒中危险因素的归因负担及变化趋势[J].中华疾病控制杂志,2022,26(1):28-33.

[3]石庆丽,贾嘉琦,李秀艳,等.急性缺血性脑卒中患者血清Hcy､lncRNA CAI2和ERCC1表达水平与预测并发认知障碍的价值研究[J].现代检验医学杂志,2022,37(4):53-58.

[8]中华医学会神经病学分会,中华医学会神经病学分会脑血管病学组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018[J].中华神经科杂志,2018,51(9):666-682.

[10]中国医师协会神经内科分会认知障碍专业委员会,《中国血管性认知障碍诊治指南》编写组.2019年中国血管性认知障碍诊治指南[J].中华医学杂志,2019,99(35):2737-2744.

[11]张磊,刘建民.改良Rankin量表[J].中华神经外科杂志,2012,28(5):1-12.

基金资助:黑龙江省自然科学基金项目(A20210215);

文章来源:李艳,王瑶,王冬梅.急性缺血性脑卒中患者血浆CircOGDH､CircHECTD1表达及临床意义[J].国际检验医学杂志,2024,45(13):1558-1563.