牙发育是牙源性上皮与牙源性间充质相互作用的结果。多种基因和信号通路在细胞增殖和分化的时空调控中发挥重要作用，如Wnt信号通路以及成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGF)信号通路等[1]。局部高效的细胞增殖是牙齿形态发育的重要环节。牙源性间充质主导牙齿发育的速度，决定牙齿的体积大小[2,3]。有研究发现小鼠牙间充质细胞中FGF8信号异常激活，加速细胞周期从G1期进入S期，从而促进细胞异常增殖，导致牙发育异常[4]。

机体细胞增殖主要以细胞自主行为及细胞非自主行为实现，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)通过细胞非自主方式调控器官发育[5]。ECM成分主要包括纤维形成蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖及糖胺聚糖等高酸性水合分子[6]。透明质酸(hyaluronan, HA)是一种独特的无核心蛋白的糖胺聚糖，生理状态下主要以高分子量形式(>1000 kDa)“包被”在细胞周围，形成细胞空间缓冲层[7]。HA的功能发挥依赖于其合成酶和降解酶的调控，透明质酸酶2(hyaluronidase 2,HYAL2)参与降解ECM中高分子量HA至20 kDa左右，后转运至溶酶体中通过HYAL1进一步降解为双糖或四糖[8]。

HA作为ECM的关键组成部分，可以通过调控细胞增殖、迁移以及分化，参与机体形态发生[9]。小鼠腭发育过程中，敲除颅神经嵴间充质细胞谱系的透明质酸合成酶2,HA合成受到抑制， 但腭板前部区域细胞增殖能力增加[10];使用HA合成抑制剂4甲基伞形酮处理胚胎期14.5 d的小鼠下颌第一磨牙牙胚，可以促进有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3表达，同时第一磨牙牙胚体积明显增大[11];而高浓度的HA作用于人胚胎来源的间充质干细胞，却使其进入缓慢增殖的休眠状态[12];以上研究提示HA可能对多种间充质细胞的增殖能力产生影响。前期研究也发现在小鼠下颌第一磨牙及切牙发育过程中，HA主要定位于磨牙及切牙根尖牙乳头间充质细胞区域[13],然而牙发育过程中内源性HA是否参与小鼠牙胚间充质细胞增殖行为的调控中仍不清楚。因此，本研究旨在探讨内源性HA在小鼠牙乳头细胞(mouse dental papilla cells, mDPCs)增殖表型中的作用。

1、对象与方法

1.1 实验动物

本研究所有动物实验均经同济大学附属口腔医院伦理委员会批准(批准号：[2019]-DW-011)。以小鼠出生的上午计为出生后0.5天(postnatal day 0.5, PN0.5)。取PN2.5的C57BL/6J小鼠5只。实验小鼠均为无特定病原体级，购于上海雷根实验动物有限公司。

1.2 主要仪器和试剂

α-MEM培养基、青/链霉素(Hyclone, 美国);胎牛血清(Excel, 中国);波形蛋白(Vimentin)、角蛋白14(Cytokeratin14)抗体(Abcam, 英国);透明质酸酶(Sigma, 德国);EdU-594细胞增殖检测试剂盒、柠檬酸钠抗原修复液(50×)、CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、Alexa Flour®488 标记链霉亲和素(上海翌圣生物科技股份有限公司);总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(Takara, 日本);生物素标记的透明质酸结合蛋白(biotinylated hyaluronan binding protein, bHABP,Millipore, 美国)。

1.3 方法

1.3.1 取材与石蜡切片制备

选取PN 2.5仔鼠，收样前4 h进行腹腔注射EdU溶液，取仔鼠头部于4%多聚甲醛溶液中4 ℃ 固定24 h, 脱钙2 d, 脱水，石蜡包埋；进行矢状面4 μm厚度的连续石蜡切片。

1.3.2 组织免疫荧光染色

切片进行脱蜡，柠檬酸钠抗原修复液高温抗原修复，山羊血清室温封闭30 min, 生物素亲和素封闭；滴加bHABP一抗(1∶100,5 μg/mL),4 ℃孵育过夜；链霉亲和素耦联二抗(1∶500)室温孵育1 h; EdU细胞增殖检测试剂室温避光孵育30 min; 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色5 min; 防荧光淬灭剂封片。

1.3.3 mDPCs原代细胞分离、培养

取胚胎期16.5 d的仔鼠，体视显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚，使用200 μL Ⅰ型胶原酶37 ℃孵育箱中消化1 h, 终止消化，离心，重悬，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；细胞融合至80%进行传代培养，使用第2代细胞进行后续实验。

1.3.4 CCK-8

将mDPCs以2×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中，饥饿24h。透明质酸酶(hyaluronidase, HAase)按浓度梯度分组：对照组(PBS组),200、400、800、1600、3200 μg/mL。1、3、5和7 d时，换液后每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h, 使用酶标仪测定450 nm波长的平均光密度值。

1.3.5 细胞免疫荧光染色

4%多聚甲醛固定细胞15 min, 山羊血清室温封闭1 h, 一抗混合液(Vimentin 抗体1∶200, Cytokeratin14抗体1∶100),4 ℃孵育过夜，荧光二抗(1∶1000)室温孵育1 h; DAPI染色5 min, 防荧光淬灭剂封片。bHABP细胞染色：山羊血清室温封闭30 min, 生物素亲和素封闭15 min; 滴加bHABP一抗(1∶100,5 μg/mL),4 ℃孵育过夜，链霉亲和素耦联二抗(1∶500)室温孵育1 h; DAPI染色5 min, 防荧光淬灭剂封片。

1.3.6 流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡

细胞周期：收集对数期细胞，消化，离心，洗涤，预冷的70%乙醇，4 ℃固定24 h, 1000 g转速离心5 min, 弃上清，预冷PBS洗涤。每管加入500 μL配置的碘化丙啶染色液，充分重悬，37 ℃避光孵育30 min, 使用流式细胞仪检测细胞周期分布。细胞凋亡：收集细胞培养液，消化，使用收集的培养液进行终止消化，离心，洗涤，重悬，加入195 μL的结合缓冲液轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，加入10 μL碘化丙啶染色液，混匀，室温避光孵育20 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.7 细胞转染

用Lipofectamine 3000(Invitrogen 公司)靶向转染Hyal2的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)及对照siRNA(siCtrl)。siHyal2购自擎科生物技术有限公司，序列：5’-GACUCGGAAGACGCUUCAA-3’和5’-UUGAAGCGUCUUCCGAGUC-3’。

1.3.8 EdU标记实验

细胞分为对照组(PBS组)和HAase组处理48 h, 以及siCtrl组和siHyal2组处理96 h, 后加入EdU工作液孵育10 h, 4%多聚甲醛液固定，配置反应体系，室温避光孵育30 min, DAPI复染5 min, 防荧光淬灭剂封片。

1.3.9 实时定量逆转录聚合酶链反应(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)

TRIzol试剂提取mDPCs的总RNA,使用 PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA。使用 HieffTMqPCR®SYBR Green Master Mix进行mRNA表达水平检测，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Gapdh)作为内参基因。采用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。所用引物序列见表1。

表1qRT-PCR引物序列

1.4 统计学分析

本研究实验数据均进行了3次独立重复实验。采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计学分析， 结果以

表述。两组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 HA在小鼠切牙根尖牙乳头的分布特征

对注射EdU标记的小鼠进行bHABP免疫荧光染色，结果显示(图1),唇侧颈环近中根尖牙乳头散在分布少量EdU+的慢增殖间充质细胞，HA在该区域高表达；间充质细胞在分化为前成牙本质细胞前进入TACs阶段，该群细胞HA的表达显著减少，提示HA的降解可能与牙间充质细胞退出静息状态并快速增殖具有相关性。

2.2 mDPCs间充质来源鉴定结果

细胞免疫荧光染色显示(图2),间充质来源细胞标志物波形蛋白染色阳性，上皮来源细胞表面角蛋白14染色阴性，提示mDPCs为间充质来源细胞。

图1小鼠下颌切牙根尖HA与EdU+细胞表达情况

图2mDPCs中Vimentin及Cytokeratin14 的表达情况(×100)

图3HAase对mDPCs增殖以及细胞形态的影响

图4HAase处理mDPCs 48 h后，EdU荧光染色检测处于S期的细胞比例(×200)

2.3 不同浓度HAase对mDPCs增殖及细胞形态的影响

使用不同浓度的HAase处理mDPCs, CCK-8检测结果显示，HAase处理促进细胞增殖并具有剂量依赖性，400 μg/mL及更高浓度HAase对细胞增殖均有显著促进作用(P<0.0001),800 μg/mL的HAase是细胞增殖效果达平台最小浓度(图3a),因此采用该浓度进行后续实验。有趣的是，在细胞培养的第5天，在光镜下观察细胞形态发现，HAase组细胞由多角形向梭形变化(图3b, 3c)。

2.4 HA降解促进细胞增殖

细胞免疫荧光染色显示(图4),与PBS组相比，HAase处理48 h后，HA表达降低，提示ECM中HA被酶分解；EdU标记实验结果显示，HAase组EdU+细胞(S期细胞)比率明显增加(P<0.01),表明HA的分解促进mDPCs的DNA合成，加速细胞增殖。

2.5 HA降解对mDPCs细胞周期的影响

HAase处理48 h后，流式细胞检测结果表明，HAase组细胞处于S期的比率明显高于对照组(P<0.05),而G0/G1期所占百分比则明显低于对照组(P<0.01),表明HAase促进静止期细胞进入DNA合成期(表2)。

表2各期细胞周期分布比率定量分析

2.6 HA降解对mDPCs细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果表明，与PBS组相比，HAase组细胞早期凋亡率明显降低(P<0.05),然而晚期凋亡率却无明显统计学差异(P>0.05,表3)。

2.7 Hyal2敲降后HA高表达

为检测HA的积聚对细胞增殖的影响，使用siRNA沉默HA降解酶。qRT-PCR分析siHyal2转染效率显示，与siCtrl组相比，siHyal2组的敲降效率约66.79%(P<0.0001),另外，siHyal2处理细胞96 h后，免疫荧光染色显示，siHyal2组HYAL2蛋白表达受到抑制；免疫荧光检测其底物HA,发现HA在细胞周围积聚增加(图5)。

图5siCtrl和siHyal2处理96 h后HYAL2蛋白(×400)以及底物HA(×400)的表达情况

图6转染48 h后，EdU荧光染色检测处于S期的细胞比例(×200)

表3各阶段细胞凋亡率定量分析

2.8 HA积聚抑制细胞增殖

EdU检测表明(图6),与siCtrl组相比，siHyal2组处于S期的EdU+细胞比率明显降低(P<0.01),表明干扰HA降解酶后，HA积聚导致mDPCs增殖活力下降。

3、讨论

ECM组成的变化可以触发静息状态的成体干细胞进入增殖、分化等活化状态[14]。本次研究结果发现，HA降解引起 ECM组成改变，促进细胞增殖；当HA降解受到抑制，积聚在细胞周围，抑制细胞增殖。上述结果表明细胞外微环境中内源性HA参与调控mDPCs增殖。

在小鼠切牙中存在一群介于干细胞和分化细胞之间的中间体细胞，是具有快速增殖能力的未分化细胞群，称为转运扩增细胞(transit-amplifying cells, TACs)[15]。一旦干细胞退出静止状态，就会开始快速增殖成为TACs[16]。本研究使用EdU标记体内快速增殖细胞群，发现HA从慢增殖间充质细胞到TACs转变过程中表达降低，提示HA的分解可能参与牙源性间充质细胞退出静息状态。因此，本研究使用外源性HAase模拟体内HA降解，初步探讨HAase浓度与细胞增殖的相关性。加入不同浓度的HAase处理mDPCs, 结果表明当HAase浓度为400 μg/mL以上均可以促进mDPCs的增殖。这与Sullivan等[17]结果一致，他们使用该酶处理了多种永生化及原代细胞，发现其可以通过提高细胞糖酵解而促进肿瘤细胞增殖。

HYAL2是大分子量HA的主要代谢酶，与CD44共同将大分子量HA降解为中等分子量。本研究使用siHyal2处理mDPCs, 模拟细胞外HA积聚。抑制HYAL2的表达导致细胞外HA表达明显增加，进一步抑制了mDPCs细胞增殖。这与既往研究中发现的高分子量HA可以通过结合并聚集乳腺癌细胞CD44受体，激活下游Hippo信号通路，从而抑制细胞增殖的结果一致[18]。以上研究结果提示HA在细胞增殖中的作用与其分子量大小具有相关性。

近年来研究发现HA可以通过改变细胞周期相关调节因子维持间充质干细胞及肿瘤细胞的休眠模式[19]。本研究发现HAase处理后S期细胞比例明显增加，而处于G0/G1期的细胞比例降低，另外HAase处理后细胞早期凋亡率降低。以上结果表明HA的降解可以通过调控细胞周期进展，同时降低细胞早期凋亡促进mDPCs增殖。长期以来研究认为细胞周期是受到细胞-ECM粘附以及接触界面的物理感受调节[20]。也有研究发现细胞感受到较高张力的情况下，G1期过渡到S期的细胞比率增加，并缩短整个细胞周期时间[21]。而HAase是否通过影响ECM的刚度改变细胞对机械力的感受，从而改变细胞增殖能力有待进一步研究。

综上，本研究通过改变内源性HA的表达水平，从细胞DNA复制、细胞周期调控以及对细胞凋亡的影响等不同方面证实HA的代谢促进mDPCs增殖，其具体调节机制仍需要进一步探索。

基金资助:国家自然科学基金(编号:8230035085); 上海市卫生健康委员会科研项目(编号:202140357); 上海申康医院发展中心新兴前沿技术联合攻关项目(编号:SHDC12023115);

文章来源:黄海燕,颜燕宏,刘塬,等.内源性透明质酸对小鼠牙乳头细胞增殖的影响[J].口腔医学研究,2024,40(07):593-598.