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MiR-449c-5p对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响及机制研究

2024-09-14 14 上传者：管理员

摘要：目的探究mi R-449c-5p对卵巢癌细胞紫杉醇（paclitaxel, PTX）耐药影响及潜在调控机制。方法 q RT-PCR检测mi R-449c-5p表达，蛋白免疫印迹分析ABCC1的蛋白表达。将mi R-449c-5p、mi R-NC、ABCC1过表达载体以及pc DNA 3.1（+）载体转染PTX耐药的卵巢癌细胞A2780/PTX和SKOV3/PTX，利用CCK-8法以及transwell实验分析细胞表型变化。双荧光素酶报告实验鉴定mi R-449c-5p和ABCC1之间的联系。移植瘤鼠模型实验体内分析mi R-449c-5p和PTX联合处理对肿瘤生长的影响。结果与HOSEPi C细胞相比，mi R-449c-5p表达在A2780和SKOV3细胞中较低（P <0.05），在A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞中最低（P <0.05）。mi R-449c-5p在A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞中靶向ABCC1。与mi R-NC转染组相比，mi R-449c-5p转染组中IC50值降低、侵袭细胞数减少（P <0.05）；和mi R-449c-5p和pc DNA共转染组比较，mi R-449c-5p和ABCC1共转染组的PTX的IC50值显著增加、侵袭细胞数增加（P <0.05）。和mi R-NC+PBS组比较，鼠模型移植瘤体积在mi R-NC+PTX组和mi R-449c-5p+PBS组显著降低（P <0.05），与mi R-NC+PTX组比较，移植瘤体积在mi R-449c-5p+PTX组显著降低（P <0.05）。结论 Mi R-449c-5p通过调控ABCC1提高卵巢癌对PTX的敏感性。

关键词：
ABCC1
miR-449c-5p
PTx
卵巢癌
紫杉醇
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卵巢癌具有病死率高，转移率高的特点[1]。卵巢癌患者通常在晚期阶段确诊，并会出现化疗药物的耐药性[2]。紫杉醇（paclitaxel,PTX）是一类能够稳定微管的紫杉烷，常用来治疗卵巢癌，但其在卵巢癌患者中出现的耐药性使得它的疗效受限。微小RNAs(micro RNAs,mi RNAs）能够在身体不同组织和体液中表达，是医学研究的一个重要领域[3]。这些小非编码RNAs能够通过结合m RNA识别位点在转录后水平影响m RNA表达[4]。Mi R-449c-5p是mi RNAs家族成员，目前没有研究分析PTX在卵巢癌细胞中耐药机制是否涉及mi R-449c-5p。因此，本研究旨在探讨mi R-449c-5p对卵巢癌细胞紫杉醇耐药影响及潜在调控机制。

1、材料与方法

一、主要试剂和仪器

Mc Coy’s 5a培养基、荧光素酶检测试剂、Lipo脂质体3000、CCK-8试剂、多聚甲醛、结晶紫、羊抗兔Ig G抗体、DMEM培养基和RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物；mi RNA反转录试剂盒、Green q PCR Super Mix、Fast Multi Site Mutagenesis System、Cell Apoptosis Detection Kit、Easy Pure®mi RNA Kit购自北京全式金生物；ABCC1一抗抗体（#PA5-30594）和实时荧光定量PCR系统购自美国Thermo Fisher公司；卵巢癌细胞系A2780和SKOV3购自武汉普诺赛生物；稳定表达mi R-449c-5p的SKOV3/PTX细胞系、实验中所用定量引物、mi R-449c-5p模拟物、模拟物对照和ABCC1过表达载体购自上海吉满生物；人卵巢上皮细胞HOSEPi C购自武汉华拓生物；PTX抗性SKOV3细胞（SKOV3/PTX）购自上海信裕生物；PTX抗性A2780细胞（A2780/PTX）购自上海传秋生物；BALB/c裸鼠购自湖南斯莱克景达有限公司。

二、实验方法

1. 细胞处理与分组：

依据Lipo脂质体3000说明书将脂质体3000和mi R-449c-5p模拟物、ABCC1过表达质粒以及相应的对照转染到A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞中，分为miR-NC组、mi R-449c-5p组、mi R-449c-5p+pc DNA组和mi R-449c-5p+ABCC1组。转染48 h后，收集每孔细胞用于相应的功能分析实验。

2. Mi RNA表达定量分析：

收集培养的卵巢癌细胞，运用Easy Pure®mi RNA Kit提取mi RNA，取适量提取的mi RNA，根据mi RNA反转录试剂盒说明书合成c DNA。随后在实时荧光定量PCR系统上分析目的mi RNA表达。数据利用2–ΔΔCt法分析。

3. PTX抗性实验：

PTX对A2780、A2780/PTX、SKOV3和SKOV3/PTX细胞抗性利用CCK-8实验分析。将以上细胞正常培养24 h后与不同浓度的PTX孵育2 d，利用磷酸缓冲液洗涤细胞两次后，每孔中添加CCK-8试剂并孵育3 h。利用酶标仪分析样品。最终计算PTX抑制细胞生长50%(half maximal inhibitory concentration,IC50）的浓度以分析PTX抗性。

4. Transwell实验：

不同转染的A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞接种到24孔的Transwell上室，在Transwell下室加有相应含有高血清的培养基。培养2 d后，于倒置显微镜下分析染色细胞。

5. Mi R-449c-5p和ABCC1关系鉴定：

在线数据库预测mi R-449c-5p和ABCC1互补位点。野生型报告质粒WT-ABCC1 3’UTR和突变型报告质粒MUT-ABCC1 3’UTR根据预测的互补位点构建。根据实验目的将报告质粒转染细胞，最终用荧光素酶检测试剂检测荧光素酶活性。

6. ABCC1蛋白表达分析：

从培养的细胞中提取蛋白，将相应体积的样品经SDS-PAGE电泳。分离的条带经全蛋白质转印系统转移到PVDF膜上，随后与ABCC1一抗抗体孵育。化学发光成像分析仪分析膜上条带。

7. 移植瘤鼠模型实验：

将稳定表达mi R-449c-5p或者mi R-NC的SKOV3/PTX细胞系分别皮下注射到12只6周龄雌性BALB/c无胸腺裸鼠背部右侧。注射后7 d，每3 d注射磷酸缓冲液或者PTX到相应组鼠的腹腔直到实验结束。22 d后将全部小鼠安乐死，收集移植瘤用于后续试验分析。

三、统计学分析

数据运用Graph Pad Prism软件分析，结果以均值±标准差表示。两组间差异利用t检验和方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

一、Mi R-449c-5p在PTX耐药的卵巢癌细胞株中表达下调

PTX的IC50值在A2780/PTX(768.00±39.36）和SKOV3/PTX细胞（984.00±74.73）中比在A2780(143.50±44.55）和SKOV3细胞（204.33±40.02）中高（P<0.05）。与HOSEPi C细胞比较，mi R-449c-5p表达在A2780(1.00±0.10)vs (0.70±0.08）和SKOV3细胞（1.00±0.10) vs (0.59±0.07）中较低（P<0.05），在A2780/PTX(1.00±0.10) vs(0.27±0.07）和SKOV3/PTX细胞（1.00±0.10) vs(0.22±0.07）中最低（P<0.05）。

二、Mi R-449c-5p过表达提高了A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞对PTX的敏感性

Mi R-449c-5p表达在mi R-449c-5p转染的A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞中比在mi R-NC转染的细胞中高（P<0.05）见图1。PTX在mi R-449c-5p转染组的IC50值低于mi R-NC转染组的（P<0.05），见图2。与mi R-NC转染组相比，mi R-449c-5p转染组中侵袭细胞数减少（P<0.05），见图3。

图1 miR-449c-5p的表达分析

图2 PTX在A2780/PTX IC50值检测

三、Mi R-449c-5p调控ABCC1

mi R-449c-5p包含ABCC1结合位点。并且数据显示mi R-449c-5p和WT-ABCC1 3’UTR转染的A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞荧光素酶活性被显著抑制（P<0.05），但是在mi R-449c-5p和MUT-ABCC1 3’UTR共转染的细胞中没有明显变化。

图3 mi R-449c-5p过表达在A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞中对细胞侵袭的影响

Fig 3 The effect of overexpression of mi R-449c-5p on cell invasion in A2780/PTX and SKOV3/PTX cells

四、Mi R-449c-5p通过调控ABCC1介导A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞对PTX的敏感性

ABCC1在mi R-449c-5p转染组的蛋白表达显著低于mi R-NC转染组的（P<0.05），但是在mi R-449c-5p+ABCC1转染组的显著高于mi R-449c-5p+pc DNA转染组的（P<0.05），见图4。并且和mi R-NC转染组比较，mi R-449c-5p转染组中PTX的IC50值显著降低、侵袭细胞数增加（P<0.05）；和mi R-449c-5p+pc DNA转染组比较，mi R-449c-5p+ABCC1转染组的PTX的IC50值显著增加、侵袭细胞数增加（P<0.05）（图5～图6）。

图4 ABCC1的表达分析

图5 PTX在A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞中的IC50值检测

图6 mi R-449c-5p和ABCC1过表达在A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞中对细胞侵袭的影响

五、Mi R-449c-5p在移植瘤鼠模型中提高了PTX的敏感性

与miR-NC+PBS组比较，鼠模型移植瘤体积在miR-NC+PTX组和miR-449c-5p+PBS组显著降低（P<0.05），与mi R-NC+PTX组比较，移植瘤体积在mi R-449c-5p+PTX组显著降低（P<0.05），见图7。与mi R-NC+PBS组比较，mi R-449c-5p+PBS组中mi R-449c-5p表达显著增加（P<0.05）；与mi R-NC+PTX组比较，mi R-449c-5p+PTX组中mi R-449c-5p表达显著增加（P<0.05），见图8。

图7 移植瘤体积分析

图8 mi R-449c-5p和PTX共处理对mi R-449c-5p表达的影响

3、讨论

研究指出PTX在卵巢癌细胞中的敏感性和mi RNAs有关。例如，Zhan等[5]指出mi R-149低表达增加卵巢癌细胞对PTX的抗性，并且此相关机制涉及mi R-149对骨髓分化因子88的负调控。另外mi R-574-3p表达下调有助于卵巢癌细胞对PTX抗性，且色素框同源物2表达下调可以缓解mi R-574-3p抑制剂对PTX有抗性的卵巢癌细胞增殖和侵袭调控的影响[6]。Mi R-449c-5p是一种抑癌基因，其异常表达可能和胶质母细胞瘤[7]以及肝细胞癌[8]恶性有关。但其在卵巢癌疾病发展尤其是在卵巢癌对PTX耐药性分子机制方面暂未见文献报道，故本研究围绕此问题开展。卵巢癌细胞的分析数据展示mi R-449c-5p在对PTX有抗性的卵巢癌细胞中表达下调，并且mi R-449c-5p模拟物转染后抑制了对PTX有抗性的卵巢癌细胞侵袭。CCK-8实验以及移植瘤鼠模型实验结果揭示mi R-449c-5p过表达有助于提高卵巢癌细胞对PTX敏感性。

ABCC1是ABC转运蛋白的C亚家族成员，具有将化疗药物排出癌细胞的能力[9]。研究表明ABCC1能够通过circ SETDB1/mi R-508-3p/ABCC1通路[10]和LINC01118/mi R-134/ABCC1通路[11]提高卵巢癌对PTX的耐药性。本研究证明miR-449c-5p调控ABCC1。ABCC1高表达能够缓解miR-449c-5p对A2780/PTX和SKOV3/PTX细胞侵袭和PTX敏感性的影响。这些数据表明mi R-449c-5p通过调控ABCC1介导卵巢癌细胞对PTX的耐药性。

因此本研究揭示了卵巢癌细胞耐PTX化疗的一种新机制，并说明了mi R-449c-5p可能是治疗卵巢癌的新靶点。然而本研究并没有探究ABCC1在卵巢癌细胞中调控PTX敏感性的机制，这点还需在后续的研究中说明。

参考文献:

[1]朱崇元,李艺.卵巢癌淋巴结转移影像学评估研究进展[J].中国妇产科临床杂志, 2023, 24(2):206-208.

[6]谢文阳,熊员焕,郭桃英. miR-574-3p通过下调CBX2增强了卵巢癌A2780细胞对紫杉醇的敏感性[J].沈阳药科大学学报,2022, 39(8):950-956.

基金资助:河南省医学科技攻关计划联合共建项目(LHGJ20210914); 新乡市科技攻关项目(GG2020041);

文章来源:高玉霞,王文翔,李章欢,等.MiR-449c-5p对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响及机制研究[J].中国妇产科临床杂志,2024,25(05):404-407.