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襄阳市腹泻患者肠炎沙门菌分子特征及耐药表型分析

2024-11-20 3 上传者：管理员

摘要：目的研究分析襄阳市腹泻患者肠炎沙门菌分离株的血清型、耐药情况与分子分型特征。方法对2019—2020年腹泻患者肠炎沙门菌株开展血清分型、药物敏感试验、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型、全基因组测序分析。结果药敏结果显示该地区肠炎沙门氏菌呈现出不同程度的耐药性，其中94.7%的肠炎沙门菌株为多重耐药菌株。肠炎沙门菌PFGE电泳图谱经聚类分析显示，19株菌可分为6种PFGE带型，其中流行优势型包含12株菌。MLST分型显示，15株菌均为ST11型，均携带多重耐药基因(mdsA、mdsB、mdsC、gols、sdiA)及MdtK基因，均携带各种侵袭力相关毒力基因，但不同菌株间所携带的致病岛分泌系统相关毒力基因略有差别。系统进化发育树分析结果显示15株菌可分成2个不同进化分支。结论襄阳地区肠炎沙门菌多重耐药状况较为严重，存在优势PFGE带型和ST型，并且携带多重耐药基因及多种侵袭力相关毒力基因。

关键词：
全基因测序
分子分型
沙门菌
耐药
食源性疾病
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沙门菌在自然界分布广泛，是最常见的引起食源性疾病的病原菌[1]。我国每年由沙门氏菌引起的感染病例占细菌食源性疾病总数70%～80%[2]。肠炎沙门菌可引起人类自限性肠胃炎，严重导致死亡；食用携带肠炎沙门菌的家禽及受其污染的产品可导致人类肠炎沙门菌暴发，在我国肠炎沙门菌成为引发感染性腹泻的优势血清型[3]。为了解襄阳市腹泻患者中肠炎沙门菌耐药性和分子分型特征及变迁趋势，研究通过对2019—2020年襄阳市国家致病菌识别网哨点监测医院腹泻患者中所分离出的肠炎沙门菌进行血清分型、药物敏感性及分子特征进行分析研究，为提升暴发疫情预警、及时追溯传染来源和传播途径及制定防控策略提供依据。

1、材料与方法

1.1 菌株来源

2019—2020年襄阳市国家致病菌识别网哨点监测医院临床患者标本分离得到的19株肠炎沙门菌菌株。

1.2 仪器和试剂

全自动生化分析仪(法国梅里埃公司),脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)。沙门菌诊断血清(丹麦SSI公司),革兰阴性需氧菌药敏检测板(上海星佰生物技术有限公司),限制性内切酶XbaI (宝生物工程(大连)有限公司),全基因组DNA纯化试剂盒(美国Promega公司)等。以上试剂均在有效期内使用。

1.3 方法

1.3.1 菌株复核分型

对菌株进行复苏纯化后进行生化鉴定确认。生化确认为沙门菌后，使用沙门菌诊断血清进行血清分型，均为肠炎沙门菌。

1.3.2 药敏试验

采用微量肉汤稀释法对最低抑菌浓度(MIC值)进行测定，按照革兰阴性需氧菌药敏检测板说明书操作和判读MIC值，并根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100药敏试验指南进行进行结果判定。

1.3.3 PFGE分型

根据国家致病菌识别网技术手册(2022年版),XbaI限制性内切酶、37℃酶切3h, 电泳时间19h。进行染色、脱色，再采用凝胶成像系统获取图像。PFGE图像导入国家致病菌识别网信息系统，设置条带位置差异容许度为1.5%,进行聚类分析。相似度100%认定为同一PFGE带型。

1.3.4 全基因组二代测序及基因组特征分析

从19株肠炎沙门菌中挑选15株提取细菌全基因组DNA。采用MGISEQ-2000平台进行双端150测序，由武汉华大医学检验所完成。采用CLC genomics workbench 20 软件(Qiagen)组装，得到contigs序列。同从NCBI上下载的参考基因组(AM933172)进行比较，构建SNP tree。全基因组序列在基因组流行病学中心(CGE)网站(http: //www.genomicepidemiology.org/)进行多位点序列分型(MLST)、毒力基因识别VFDB网站(http: //www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cg)等分析，使用耐药基因库CARD查找耐药基因。

2、结果

2.1 菌株复核结果

将收集到肠炎沙门菌经生化及血清复核后获得19株肠炎沙门菌。其中10株为2019年收集，9株为2020年收集；11株分离自男性，8株分离自女性；16株来源于粪便，3株来源于血液。

2.2 耐药性分析

研究选用了临床上针对肠杆菌科常用的12类20种抗生素进行药敏表型分析。19株肠炎沙门对其中14种药物呈不同程度耐药，耐药率 5.26%～94.74%,其中对氨苄西林、多粘菌素 E的耐药率最高(94.74%),其次为氨苄西林-舒巴坦(78.95%)、头孢唑林(73.68%)。对头孢西丁、庆大霉素、阿米卡星完全敏感(100%),对氯霉素、头孢他啶敏感率为94.74%,对头孢噻肟、美罗培南敏感率为89.47%。临床常用的三代头孢类药物中，头孢类均较为敏感(头孢他啶94.74%、头孢噻肟89.47%、头孢吡肟84.21%),而喹诺酮类药物敏感性较低(环丙沙星为5.26%)。

参照《MDR、XDR、PDR多重耐药菌暂行标准定义-国际专家建议》中肠杆菌科抗菌药物类别条目定义，对3类或3类以上抗菌药物不敏感定义为多重耐药株。94.7%(18株)的菌株为多重耐药性(MDR)菌株，对9类、8类、7类、6类、5类、4类药物不敏感的菌株比例依次为11.11%(2/18)、11.11%(2/18)、5.56%(1/18)、38.89%(7/18)、27.78%(5/18)、5.56%(1/18)。进一步对耐药谱分析可发现，有6株MDR菌株耐药谱为青霉素类-多粘菌素类-四环素类-第一/二代头孢菌素-β-内酰胺酶抑制剂，有4株MDR菌株耐药谱为青霉素类-多粘菌素类-第一/二代头孢菌素-β-内酰胺酶抑制剂。在2020年襄城区粪便分离出的1株菌(XY2020036-Sal)对13种共7类药物耐药(青霉素类、四环素类、碳青霉烯类、多粘菌素类、第一/二代头孢菌素、单环β-内酰胺类、青霉素类+β-内酰胺酶抑制剂),其耐药谱分布较广。

2.3 PFGE分型结果

18株肠炎沙门菌PFGE电泳后图谱经聚类分析显示，可分为6个型别，其中12株肠炎沙门菌均为统一带型，为该地区该血清型菌株的主要优势带型。研究中2019年的8株和2020年的4株肠炎沙门均呈现了高度的一致性，2020年襄城区的1株菌和樊城区的1株菌为同一PFGE带型，与主优势带型相似度较高。

2.4 全基因组测序及wgSNP分型

MLST分型结果显示，15株肠炎沙门菌均为ST11型。耐药基因分析发现15株菌均携带6种耐药基因，包括介导多重耐药的外排泵基因mdsA、mdsB、mdsC、gols、sdiA和介导氟喹诺酮类耐药的MdtK基因。毒力基因分析发现所有菌株均携带csg(A、D-G)、Bcf、Fim(A、C、D、F、H、I)、Lpf等结构性毒力因子，PhoPQ等调控相关毒力因子，Mig-14、Mig-15等巨噬细胞诱导基因。部分菌株还携带有外毒素SpvB、伤寒毒素、LPS、抗压生存相关基因SodCI等，不同菌株间所携带的致病岛分泌系统相关毒力基因(ssa、ssr、avrA、sopE、spvD、sse、aec30等)也有所差别(图2)。

基于wgSNP的系统进化发育树分析结果显示，15株菌可分成2个不同的进化分支(图2),其中2019124与2019173形成一个独立进化分支。而其余菌株则形成一个大进化分支，并以此在内部又被各分成不同亚分支，不同分离时期和来源的菌株分散分布在不同进化分支中。

表1肠炎沙门菌药敏试验结果[n(%)]

图1肠炎沙门菌的PFGE图谱聚类分析

图2基于wgSNP对15株肠炎沙门菌进行聚类分析结果

3、讨论

沙门菌的血清型有明显的地域差别。根据2019—2020年的沙门菌监测结果显示，该市沙门菌血清型以鼠伤寒沙门菌与肠炎沙门菌为主，与江苏省(2015—2020年)[4]研究结果一致。然而，研究发现PFGE分型与血清型并非精确吻合，与诸多研究一致[5-6]。PFGE对肠炎沙门菌菌株和群的鉴别能力有限，可能是因为血清分型识别的抗原决定基因在遗传关系远的沙门菌菌株间水平转移，导致血清型相同的两者在基因组进化上区别明显。

肠炎沙门菌PFGE电泳图谱经聚类分析可分为6种带型，呈现出一定的多态性。有一优势带型在该市持续流行，但并未出现沙门菌的暴发或食物中毒事件。提示可能存在相同来源暴露的肠炎沙门菌潜在暴发，处在不同地区的不同时间(2019年的樊城区和2020年襄城区)出现的同一带型提示可能存在潜在的污染源或慢性带菌者群体，呈现高度散发或潜在未识别到的小范围暴发。15株肠炎沙门均为ST11型，也是目前肠炎沙门菌主要流行的克隆型。系统进化发育树显示，15株菌可分成2个不同的进化分支，不同分离时期和来源分散分布在不同进化分支中。由于研究仅收集了患者标本，未收集环境样标本，因此未能揭示出潜在的暴露来源，还需结合流行病进一步开展聚集性病例的溯源工作，以找出可能持续存在的污染源头。

近年来，沙门菌的耐药性也不断增加，一线药物喹诺酮类和头孢菌素类药物的敏感性逐渐降低。襄阳市肠炎沙门菌对喹诺酮类、第一、二代头孢菌素敏感性较低，对三、四代头孢类较为敏感，与2016—2020年辽宁省[7]研究结果一致，提示临床用药应谨慎选这两类药物。该市肠炎沙门菌对氯霉素、亚胺培南敏感性高(94.74%、84.21%)与武汉市2021年[8]肠炎沙门菌的研究结果一致，但武汉市菌株对阿米卡星、头孢西丁、庆大霉素表现为耐药，与此次研究的结果不同。与2016—2019年北京市的研究相似[9],该市的肠炎沙门菌耐药形势严峻，94.7%的菌株对4类及以上抗菌药物不敏感，产生多重耐药性(MDR)。建议加强临床耐药性研究，掌握其变迁趋势。关注到肠炎沙门菌还携带mdsA、mdsB、mdsC、gols、sdiA等介导多重耐药的外排泵基因及介导氟喹诺酮类耐药的MdtK基因，随着可移动元件或质粒可在多个细菌属之间转移，从而表达对各种抗生素的耐药性，增加了抗感染治疗的难度。沙门菌致病机制的核心是其致病岛1和致病岛2编码的两种III型分泌系统(T3SS),这些系统参与了沙门菌对宿主细胞的粘附和侵袭过程[10],菌毛、脂多糖、肠毒素等许多毒力因子也在沙门菌感染宿主细胞、确保营养供应、与共生细菌竞争和逃避先天免疫系统中发挥重要作用[11]。所有肠炎沙门菌均携带有上述毒力因子，不同菌株间所携带的致病岛分泌系统相关毒力基因略有差别，其中有7株肠炎沙门菌所携带的毒力基因可高达80%。随着肠炎沙门氏菌耐药性不断增强，耐药谱变宽，侵袭性感染发病率和死亡率呈上升趋势，给临床治疗带来了极大的挑战[12]。通过分析侵袭相关毒力基因的携带情况，可以为可能发生的侵袭相关疾病提供预警，为其预防、早期诊断及治疗提供有力证据。

参考文献:

[1]黎明,孔喜梅,袁齐武,等.成都市未成年人群腹泻沙门氏菌血清型､耐药及分子分型研究[J].现代预防医学,2021,48( 21):3996-4027.

[3]郭国侠,孟昭倩,高夏莲,等.2021年安徽省阜阳市一起感染性腹泻暴发疫情的病原菌溯源分析[J].疾病监测,2023,38(11):1405-1409.

[4]马恺,周翌婧,郑东宇,等.2015—2020年江苏省食源性疾病主动监测沙门氏菌情况分析[J].公共卫生与预防医学,2023,33(6):33-37.

[7]耿英芝,于淼,张铭琰,等.2016—2020年辽宁省沙门菌耐药性及分子分型研究[J].中国食品卫生杂志,2022,34(3):426-431.

[8]费筱媛,王华伟,祁莉,等.2021年武汉市一起肠炎沙门菌引起的跨区食源性疾病暴发的病原学分析[J].疾病监测,2022,37(11):1495-1501.

[9]白婧,尹可欣,刘伟,等.2016—2019年北京市海淀区沙门菌血清分布､分子分型及耐药性分析[J].疾病监测,2021,36(11):1184-1189.

[11]侯悦,刘洁.肠炎沙门氏菌中侵袭相关毒力基因研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(10):7.

基金资助:湖北省卫计委科研项目(WJ2018H265); 襄阳市医疗卫生领域科技项目(2021YL42);

文章来源:史静,张雅婷,朱胜明,等.襄阳市腹泻患者肠炎沙门菌分子特征及耐药表型分析[J].公共卫生与预防医学,2024,35(06):85-88.