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膀胱癌组织中长链非编码RNA PCAT6表达情况与其临床病理参数及预后的关系

2020-07-09 312 上传者：管理员

摘要：目的检测膀胱癌组织中长链非编码RNA PCAT6(lncRNA PCAT6)表达情况,并探讨其与临床病理参数及预后的关系。方法收集2010年1月-2013年12月在内江市市中区人民医院行膀胱电切或膀胱根治性切除手术的63例膀胱癌患者的肿瘤组织及癌旁组织,采用qRT-PCR法检测膀胱癌组织及癌旁组织中lncRNA PCAT6表达情况,分析其与临床病理参数的关系,并对所有患者随访5年,分析lncRNA PCAT6与膀胱癌患者术后临床预后的关系。结果膀胱癌组织中lncRNA PCAT6相对表达量显著高于癌旁组织(P<0.05);膀胱癌组织中lncRNA PCAT6的相对表达量与病理分级、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05);随访5年,共有27例患者死亡,其中lncRNAPCAT6膀胱癌高表达患者5年总存活率为41.18%,显著低于低表达患者5年总存活率75.86%(P<0.005);Cox模型多因素分析结果显示:lncRNA PCAT6、临床分期是影响膀胱癌不良预后的独立危险因素。结论膀胱癌组织中lncRNA PCAT6表达上调,其表达水平与临床分期等临床病理特征有关,可能成为膀胱癌患者不良预后的生物标志物。

关键词：
临床病理参数
泌尿肿瘤
生物标志物
膀胱癌
长链非编码RNA PCAT6
预后
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膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的一种恶性肿瘤，其发病率位于十大恶性肿瘤的第9位[1]。近年来，膀胱癌的发病率呈逐年上升趋势，已成为威胁人类健康的重要肿瘤疾病[2]。目前治疗膀胱癌的方式是手术切除，辅助化、放疗方式，已取得一定程度进展，然而膀胱癌仍然有较高的转移率与复发率，总体生存率并无明显改善[3]。因此，早期发现膀胱癌新的治疗靶点，探索膀胱癌肿瘤不良预后的生物标志物十分重要。近年来，随着分子生物学的快速发展，长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA）与恶性肿瘤之间的关系受到人们广泛关注[4]。研究表明，lncRNA PCAT6在非小细胞肺癌组织中表达上调，可能成为非小细胞肺癌的潜在诊断及预后生物标志物[5]。但lncRNA PCAT6在膀胱癌中的表达情况及其与预后的关系，目前尚鲜有报道，基于此，本研究通过检测膀胱癌组织中lncRNA PCAT6表达情况，以期探讨其与膀胱癌临床病理参数及预后的关系。

1、材料与方法

1.1一般资料

收集2010年1月-2013年12月在内江市市中区人民医院就诊的63例膀胱癌患者为研究对象，其中男46例，女17例，年龄35～80岁，平均年龄（58.24±14.55）岁，纳入标准：(1)符合膀胱癌疾病诊断标准[6];(2)患者手术前均未经放、化疗等其他辅助性治疗。排除标准：(1)有精神疾病障碍患者；(2)有传染性疾病患者；(3)资料不全。本研究经本院伦理委员会审核同意，所有患者均已签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1样本采集与保存

取膀胱癌患者行膀胱电切或膀胱根治性切除手术后的肿瘤组织及癌旁组织（距肿瘤边缘≥3 cm），并及时将肿瘤组织及癌旁组织置于-80℃液氮中保存待用。

1.2.2组织中lncRNA PCAT6表达水平的检测

采用Trizol法提取膀胱癌组织及癌旁组织总RNA，采用电泳法及紫外分光光度计法检测RNA的完整度及纯度，采用反转录试剂盒反转录RNA得cDNA，采用miScript SYBR Green PCR Kit检测膀胱癌组织及癌旁组织中lncRNA PCAT6水平，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行，反应体系20μL,qRT-PCR反应条件：95℃，30 s;55℃，30 s;72℃，30 s，共30个循环。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及miScript SYBR Green PCR Kit均购自赛默飞世尔科技有限公司。lncRNA PCAT6及内参GAPDH的引物序列见表1。采用2-Ct法对lncRNA PCAT6表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3随访

随访日期自出院之日起至2018年12月30日，对所有患者进行门诊复查或者电话随访，随访时间为5年，调查并记录患者的生存情况。

1.3统计学分析

运用统计学软件SPSS 20.0处理数据，符合正态分布计量资料用（±s）表示，采用t检验，计数资料用n（%）表示，采用Χ2检验，单因素及多因素Cox回归模型分析影响膀胱癌患者术后临床预后的危险因素。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1总RNA浓度及质量检测结果

将组织中提取的全部RNA在紫外分光光度计上检测纯度显示，所有吸光度值（OD260/OD280）均在1.8～2.0间，浓度高，同时琼脂糖凝胶电泳结果显示，5、18、28 S三条条带清晰完整，见图1。

图1琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 lncRNA PCAT6在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达情况

膀胱癌组织中lncRNA PCAT6的相对表达量显著高于癌旁组织（P<0.05），见表2。

表2 lncRNA PCAT6在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达情况

2.3 lncRNA PCAT6与膀胱癌临床病理特征的关系

以膀胱癌组织中lncRNA PCAT6相对表达量的平均值为临界值，将其分为高表达组与低表达组，膀胱癌组织中lncRNA PCAT6相对表达量与患者性别、年龄、肿瘤直径无关（P>0.05），膀胱癌组织中lncRNA PCAT6相对表达量与病理分级、临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05），见表3。

表3 lncRNA PCAT6与膀胱癌临床病理特征的关系

2.4 lncRNA PCAT6表达水平与预后的关系

随访5年，共有27例患者死亡，其中lncRNA PCAT6膀胱癌高表达患者5年总存活率为41.18%，显著低于低表达患者5年总存活率75.86%(c2=7.674,P<0.05），见图2。

图2 lncRNA PCAT6表达水平与膀胱癌患者预后的关系

2.5影响膀胱癌患者预后因素的Cox回归分析

Cox模型单因素分析结果显示，PCAT6、淋巴结转移、临床分期、病理分级是影响膀胱癌不良预后的危险因素；Cox模型多因素分析结果显示，PCAT6、临床分期是影响膀胱癌不良预后的独立危险因素，见图3。

3、讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，按组织学类型可将膀胱癌分为鳞状细胞癌、腺癌及移行细胞癌三种类型，其中90%以上为移行细胞癌[7]。膀胱癌的发生与发展是一个多因素、多步骤的复杂生物学过程，其发生受内在的遗传因素及外在的环境因素共同影响，然而目前膀胱癌的发病机制尚未完全清楚[8]。2017年统计数据显示，我国膀胱癌发病率及死亡率均位于泌尿系统恶性肿瘤首位，且其发病率仍然有不断上升趋势[9]。据统计，我国2015年，新发膀胱癌患者超过8万例，年死亡率约3.3万例，其中男性发病率约为女性的2.5～4倍，已成为严重威胁人类健康的重要疾病[10]。研究表明，早期膀胱癌患者无明显症状，多数患者发现时已经发生转移，加大临床治疗的难度，而现有膀胱癌诊治方法尚存在不足，因此如何进一步探究膀胱癌发生、发展的分子机制，寻找可靠生物标志物，对于提高膀胱癌患者生存率具有十分重要的意义[11]。

图3影响膀胱癌患者不良预后因素的Cox回归分析

近年来，lncRNA作为肿瘤疾病诊断、治疗靶点的新型候选分子，已越来越受到人们广泛关注[12]。lncRNA是一类转录长度超过200 nt RNA，不具有蛋白质编码功能，在多种组织中均有广泛的表达谱[13]。研究表明，lncRNA在基因组印迹、转录激活与干扰、染色质修饰及靶基因结合过程中均具有重要调控作用[14]。lncRNA能够参与膀胱癌的发生、发展及转移等过程。目前已鉴定出lncRNA RP11、lncRNA H19、lncRNA UCA1、lncRNA HOTAIR、lncRNA PVT1、lncRNA SPRY4-IT1等多种lncRNA与膀胱癌发生、发展密切相关[15]。舒静等[16]研究表明，膀胱癌中差异表达的lncRNA共4 155种，其中2 045种高表达，2 110种低表达。lncRNA PCAT6是近年来新发现的一种lncRNA，与前列腺癌的细胞增殖密切相关。本研究结果显示，膀胱癌组织中lncRNA PCAT6相对表达量显著高于癌旁组织，且膀胱癌组织中lncRNA PCAT6相对表达量与病理分级、临床分期及淋巴结转移有关，提示lncRNA PCAT6在膀胱癌组织中表达上调，其表达水平可能与膀胱癌疾病发生、发展有关，在膀胱癌疾病进展中发挥致癌基因作用。

Wan等[17]研究表明，lncRNA PCAT6在肺癌细胞中表达上调，在肺癌细胞中敲除lncRNA PCAT6后，细胞增殖及转移能力显著降低，细胞凋亡率显著升高，lncRNA PCAT6在肺癌细胞中的表达水平与肺癌患者的总体存活率有关。本研究结果显示，随访5年，共有27例患者死亡，其中lncRNA PCAT6膀胱癌高表达患者5年总存活率为41.18%，显著低于低表达患者5年总存活率75.86%，提示lncRNA PCAT6表达水平与膀胱癌患者预后情况有关。同时，也可见患者总体生存率较高，但是否存在如膀胱癌复发转移所致死亡等其他致死因素而影响结果仍需深入探究，提高研究准确性。本研究进一步通过Cox模型单因素、多因素分析显示，PCAT6、淋巴结转移、临床分期、病理分级是影响膀胱癌不良预后的危险因素，PCAT6、临床分期是影响膀胱癌不良预后的独立危险因素，提示lncRNA PCAT6可能作为预测膀胱癌患者不良预后的一项生物学指标。

综上所述，膀胱癌组织中lncRNA PCAT6表达上调，其表达水平与临床分期等临床病理特征有关，可能成为膀胱癌患者不良预后的生物标志物。然而本研究所纳入样本数量较少，lncRNA PCAT6在膀胱癌中的功能及相关调控机制尚未明确，仍需进一步深入研究，下一步准备扩大样本容量，继续进行lncRNA PCAT6相关调控机制的研究。

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