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摘要:新疆许多规模化牛场存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染,且因病毒基因型具有多样性,给该病的防控、疫苗选择、净化带来了一定的困难,开展新疆地区规模化牛场BVDV基因分型鉴定,对BVDV防控具有重要的指导作用。采集BVDV胶体金抗原检测卡确定为阳性的犊牛抗凝血样品并分离淋巴细胞,在MDBK单层细胞上进行病毒分离,盲传5代,提取培养物RNA,以BVDV5′-UTR、Npro特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分析。结果显示,获得BL分离株1株,属于BVDV-1m亚型,研究结果丰富了新疆南疆地区规模牛场BVDV分子流行病学数据库。
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)属于黄病毒科、瘟病毒属,单股正链RNA病毒,与同属病毒(羊边界病毒、猪瘟病毒)具有血清学交叉反应。BVDV存在2种不同的生物型,一种在细胞培养中产生细胞病变(cytopathic effect, CPE),另一种不能。在感染的早期以及持续感染的犊牛分离的病毒是无细胞病变型(noncytopathic, NCP),且2种生物型密切相关,细胞病变型可能是由无细胞病变型突变而来,另一种可导致细胞病变称为CP型(cytopathic, CP)[1]。
BVDV于1946年在美国纽约州首次发现,1971年,美国兽医协会将其统一命名为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,以后定名为牛病毒性腹泻病毒[1]。1980年,我国学者李佑民等[2]从患病母牛的脱纤血和其流产胎儿脾脏中分离到BVDV野毒株。
BVDV基因组为具有感染性的单链正股RNA,大小约12.3 kb, 由一个开放阅读框(ORF)组成,两侧有5′和3′非翻译区(UTRs)。BVDV的5′-UTR、Npro、E2和P80等常作为该病毒基因分型鉴定的候选基因区域[3]。目前,BVDV的基因型分为2型,其中,BVDV-1型至少有21个亚型,即1a~1v, BVDV-2型有4个亚型,分别为2a、2b、2c和2d[4,5]。
近年来,新疆部分地区养殖场大量从国内部分省份(如东北地区、山东等)引入牛,在一定程度上增加了动物疫病传入的风险。针对新疆南疆某规模化肉牛场犊牛疑似感染牛病毒性腹泻病毒,本研究从血清学试验为BVDV阳性的患病犊牛采集抗凝血样,进行病毒分离,设计BVDV基因组中5′-UTR、Npro基因的特异性引物,进行RT-PCR鉴定分析,以了解新疆南疆地区BVDV基因类型,为BVDV分子流行病学研究积累资料,并为其防控措施的制定提供参考依据。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料及细胞
2022年4月,在新疆南疆某规模化肉牛场,通过临床诊断、病理观察,BVDV胶体金抗原检测卡检测为BVDV阳性的犊牛,无菌采集其抗凝血样品,并及时送实验室。流行病学调查发现该场未免疫接种牛病毒性腹泻疫苗。MDBK细胞,塔里木大学动物医学实验室保存。
1.1.2 主要试剂
Foetal Bovine Serum, BI(Biological Industries)公司产品;RPMI-1640基础培养基,武汉普诺赛生物科技有限公司产品;高糖DMEM培养基,米鼠(西安)生物科技有限公司产品;胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚红),北京索莱宝科技有限公司产品;人外周血淋巴细胞分离液,天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品;病毒检测用RNA提取试剂盒,普通琼脂糖凝胶回收试剂盒,2×Tap PCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000,天根生化科技(北京)有限公司产品;Primescript One Step RT-PCR Kit, TaKaRa生物工程有限公司产品。
1.1.3 主要仪器
二氧化碳细胞培养箱(BC-J80),上海博讯实业有限公司;台式高速速冻离心机(3-18R),北京智杰方远科技有限公司;电泳仪(LF-600),北京龙方科技有限公司;梯度PCR仪(TC-5000),伯乐生命医学产品有限公司;全能型凝胶成像系统(FlourChem R),普诺森科技(北京)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 病料处理
BVDV阳性的抗凝血样品,按照“人外周血淋巴细胞分离液”说明书操作要求,分离获得淋巴细胞,在-20 ℃反复冻融3次后,用0.22 μm的滤器进行过滤,收获滤过液放置-20 ℃保存备用。
1.2.2 分离病毒
将1.2.1步骤的滤过液接种于单层致密的MDBK细胞,吸附2 h后,补加2% DMEM维持液继续培养。每隔24 h观察1次细胞病变情况,至96 h时置于-20 ℃反复冻融3次后低温保存。按照上述步骤将病毒盲传5代。
1.2.3 病毒RNA提取
按照“病毒检测用RNA提取试剂盒”说明书操作要求,提取收获的病毒液RNA并置于-80 ℃保存备用。
1.2.4 RT-PCR检测
BVDV的5′-UTR和Npro的特异性引物[6],由上海赛恒生物科技有限公司合成(表1)。
表1 引物序列
取上述细胞培养物上清,提取基因组,按照“PrimeScrip One Step RT-PCR Kit”操作说明书,进行一步法RT-PCR,反应体系:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL,2×1 Step Buffer 25 μL,上游、下游引物各1 μL,RNase Free ddH2O 11 μL,RNA模板10 μL,总体系50 μL。RT-PCR反应条件:50 ℃ 30 min; 94 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.2.5 目的片段凝胶回收与测序
PCR扩增产物进行凝胶电泳检测、目的片段纯化回收,送至上海赛恒生物科技有限公司测序。
1.2.6 序列分析及遗传进化分析
使用DNA Star软件对分离获得的毒株核苷酸序列与从NCBI的GenBank中发布BVDV参考株序列进行核苷酸同源性分析(表2和表3),使用MEGA7.0软件构建系统发育进化树。
表2 BVDV 5′-UTR参考毒株
2、结果
2.1 病毒的分离培养
处理的淋巴细胞分离液感染MDBK细胞,观察96 h, 细胞未出现拉丝、结网、皱缩等细胞病变现象,盲传5代后未出现细胞病变,各代细胞反复冻融3次,置-20 ℃保存备用。
2.2 RT-PCR结果
提取第5代细胞冻融液RNA,以BVDV 5′-UTR基因特异性引物进行RT-PCR扩增,出现预期目的片段,大小约292 bp(图1);以Npro基因特异性引物RT-PCR扩增,出现预期目的片段,大小约736 bp(图2)。
表3 BVDV Npro参考毒株
图1 5′-UTR基因RT-PCR扩增结果
2.3 BVDV 5′-UTR和Npro基因核苷酸同源性比较
以BVDV 5′-UTR、Npro引物扩增的测序结果在NCBI中进行Blast比对,检测样品均属于BVDV 1型,命名该非致细胞病变的BVDV为BL株。
以5′-UTR基因核苷酸序列比对分析,5′-UTR-BL和25个BVDV参考毒株核苷酸同源性比较(图3),与2010年中国兰州BVDV-10毒株(JX276547)间基因序列的核苷酸同源性为95.7%,同为BVDV-1m型,与其余参考毒株的BVDV-1型间基因序列的核苷酸同源性为83.9%~89.4%;与BVDV-2型中的中国NXWZ株(OM209991)、土耳其C62019株(ON401188)的2b型的之间基因序列的核苷酸同源性分别为73.7%和74.5%。
图2 Npro基因RT-PCR扩增结果
基于Npro基因核苷酸序列比对分析,Npro-BL与21个BVDV参考毒株核苷酸同源性比较(图4),与中国哈尔滨TY05(GU120258)和中国黑龙江TJ0801株(GU120262)之间基因序列的核苷酸同源性同为92.7%,并且同为BVDV-1m型,而与意大利SI/207/12株(LN515611)的1t型之间基因序列的核苷酸同源性为63.1%;而与其余BVDV-1型之间基因序列的核苷酸同源性为70.5%~84.8%。
2.4 BVDV 5′-UTR和Npro基因遗传进化树构建
以BVDV的5′-UTR和Npro基因核苷酸序列分别构建遗传进化树(图5和图6),5′-UTR-BL与BVDV-1m型的中国兰州BVDV-10毒株(JX276547)处在同一分支上,与韩国BVDV-8067株(KY499131)的BVDV-1o型、波兰48/08株(JN715036)的BVDV-1g型、土耳其Bor4株(OM223849)的BVDV-1f型亲缘关系较近。
Npro-BL与BVDV-1m型中的中国哈尔滨TY05毒株(GU120258)处在同一分支上,且与中国黑龙江TJ0801株(GU120262)的BVDV-1m型与BJ0702株(GU120260)的BVDV-1p型亲缘关系较近。
3、讨论
BVDV可引起牛感染并表现出多种临床症状,主要有流产、先天性缺陷、新生小牛死亡、肠炎、呼吸系统疾病、免疫抑制、消瘦、不孕症和乳腺炎等[7],严重危害养牛业健康发展。
BVDV感染具有全球分布的特点,Kadir Y等[8]调查表明,BVDV-1b是全球主要的亚基因型,其次是BVDV-1a亚型和BVDV-1c亚型,美洲、亚洲、欧洲主要以BVDV-1b亚型,澳大利亚主要为BVDV-1c亚型,在南非BVDV-1a亚型比其他亚基因型更频繁地被检测到。我国的多个省(直辖市、自治区)均有相关报道且BVDV基因亚型呈多样性,大多为BVDV-1型,包含1a、1b、1c、1d、1m、1q等亚型,同时也存在BVDV-2型感染情况[9]。2023年,牛杰等[10]基于中国知网、万方、维普、PubMed、ScienceDirect等数据库,对93篇BVDV相关文献进行了系统评价、Meta分析发现,在我国许多地区牛群中BVDV流行较广。
图3 BVDV 5′-UTR核苷酸同源性比较
图4 BVDV Npro核苷酸同源性比较
新疆无论是规模牛场的牛,还是散养户的牛,都存在BVDV感染的情况,且有多种基因型。2007年,郭燕[11]通过对检测样本与BVDV参考株遗传进化分析,只有1株为BVDV-1b, 其他不属于BVDV-1中的其他亚型。2014年至2015年,陈锐等[12]研究发现新疆部分散养户肉牛以BVDV-1q、BVDV-1f型感染为主。张坤[13]自2014年1月至2016年1月,对新疆北疆地区7个规模奶牛场1月龄内犊牛开展了病原学、分子流行病学调查,结果发现部分牛场感染率较高,以BVDV-1b亚型感染为主。2015年,王龙[14]通过对新疆南北疆不同地区牛场采集的样品进行RT-PCR检测,分离获得21株BVDV,其中2株BVDV-1b、15株BVDV-1未知亚型,还有4株BVDV-Ⅱ型,表明BVDV在新疆不同地区牛场存在一定程度的感染和发生。王青青等[15]在2015年到2016年期间,对来自新疆南疆地区部分规模奶牛场的样本通过实验室检测发现,该地区规模奶牛场普遍存在BVDV感染,且存在多种基因亚型,如BVDV-1c亚型、BVDV-1b、BVDV-2a亚型和BVDV-1未知亚型的。在2018年至2019年期间,朱广艺[16]对南疆地区某规模奶牛场开展BVDV净化过程中,检测到该场存在BVDV-1c型。2019年,赵玉宾[17]对来自新疆南疆地区几个规模养鹿场的样品开展了马鹿BVDV实验室检测,检测结果表明该地区部分养鹿场均有不同程度BVDV感染且存在BVDV-1c亚型。在新疆地区BVDV不仅感染牛群,同时在马鹿养殖场也检测到BVDV的感染,说明BVDV在新疆地区感染范围较广泛。
图5 BVDV 5′-UTR基因进化树
图6 BVDV Npro基因进化树
近年来,新疆南疆地区大量从我国东北地区、山东、山西、内蒙古等大量引入肉牛,外地牛的引进增加了BVDV传入的风险。本研究中,对新疆南疆地区某规模肉牛场BVDV检测、基因型分型鉴定,确定为BVDV-1m型,通过对该牛场调查发现该场从外地引入肉牛的记录,目前,很难确定该场BVDV的感染来源。
通过上述分析,BVDV自2007年在新疆地区报道以来,规模牛场、散养户的牛均有不同程度的感染,感染范围较广且存在多种基因亚型,因此,开展流行病学调查可以为疫苗选择提供重要的参考依据。
参考文献:
[1]扈荣良.现代动物病毒学[M].北京:中国农业出版社,2014:1333-1335.
[2]李佑民,刘振润.吉林省某奶牛场暴发牛病毒性腹泻——粘膜病及其病毒分离的初步研究[J].兽医大学学报,1981(3):62-64,70.
[3]陈新诺,张斌.牛病毒性腹泻病毒的分子生物学研究进展[J].中国畜牧兽医,2017,44(11):3137-3142.
[4]秦义娴,陈晓春,刘丹,等.2株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定[J].动物医学进展,2023,44(1):43-47.
[5]李艳萍.BVDV-2型GS2018株的分离鉴定及其对牛PBLCs增殖和基因转录水平的影响[D].北京:中国农业科学院,2021.
[9]姚志兰,傅宏庆,崔平福,等.江浙部分地区牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查及BVDV-2型毒株分离鉴定[J].扬州大学学报(农业与生命科学版),2019,40(1):40-46,102.
[10]朱杰,杨才俊,祁明普,等.我国牛群中牛病毒性腹泻病毒流行的Meta分析[J].华中农业大学学报,2023,42(2):48-62.
[11]郭燕.新疆北疆部分集约化奶牛场牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查[D].新疆石河子:石河子大学,2007.
[12]陈锐,范学政,朱元源,等.西部散养肉牛病毒性腹泻病毒流行及遗传变异[J].中国农业科学,2016,49(13):2634-2641.
[13]张坤.新疆北疆地区规模化奶牛场犊牛病毒性腹泻相关病原的调查研究[D].新疆石河子:石河子大学,2016.
[14]王龙,梁霄勇,季新成,等.新疆部分地区牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定及分子流行病学调查[J].新疆农业科学,2015,52(2):334-338.
[15]王青青,张迎春,崔鑫,等.新疆南疆牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定及分析[J].畜牧与兽医,2018,50(7):113-117.
基金资助:兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室项目(ELDC202304);兵团科技局现代农业科技攻关与成果转化计划项目(2016AC012);
文章来源:黄琴,陈红强,张怡淼,等.新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定[J].动物医学进展,2024,45(07):18-23.
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