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新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定
摘要：新疆许多规模化牛场存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染，且因病毒基因型具有多样性，给该病的防控、疫苗选择、净化带来了一定的困难，开展新疆地区规模化牛场BVDV基因分型鉴定，对BVDV防控具有重要的指导作用。采集BVDV胶体金抗原检测卡确定为阳性的犊牛抗凝血样品并分离淋巴细胞，在MDBK单层细胞上进行病毒分离，盲传5代，提取培养物RNA,以BVDV5′-UTR、Npro特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分析。结果显示，获得BL分离株1株，属于BVDV-1m亚型，研究结果丰富了新疆南疆地区规模牛场BVDV分子流行病学数据库。
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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)属于黄病毒科、瘟病毒属，单股正链RNA病毒，与同属病毒(羊边界病毒、猪瘟病毒)具有血清学交叉反应。BVDV存在2种不同的生物型，一种在细胞培养中产生细胞病变(cytopathic effect, CPE),另一种不能。在感染的早期以及持续感染的犊牛分离的病毒是无细胞病变型(noncytopathic, NCP),且2种生物型密切相关，细胞病变型可能是由无细胞病变型突变而来，另一种可导致细胞病变称为CP型(cytopathic, CP)[1]。
BVDV于1946年在美国纽约州首次发现，1971年，美国兽医协会将其统一命名为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒，以后定名为牛病毒性腹泻病毒[1]。1980年，我国学者李佑民等[2]从患病母牛的脱纤血和其流产胎儿脾脏中分离到BVDV野毒株。
BVDV基因组为具有感染性的单链正股RNA,大小约12.3 kb, 由一个开放阅读框(ORF)组成，两侧有5′和3′非翻译区(UTRs)。BVDV的5′-UTR、Npro、E2和P80等常作为该病毒基因分型鉴定的候选基因区域[3]。目前，BVDV的基因型分为2型，其中，BVDV-1型至少有21个亚型，即1a～1v, BVDV-2型有4个亚型，分别为2a、2b、2c和2d[4,5]。
近年来，新疆部分地区养殖场大量从国内部分省份(如东北地区、山东等)引入牛，在一定程度上增加了动物疫病传入的风险。针对新疆南疆某规模化肉牛场犊牛疑似感染牛病毒性腹泻病毒，本研究从血清学试验为BVDV阳性的患病犊牛采集抗凝血样，进行病毒分离，设计BVDV基因组中5′-UTR、Npro基因的特异性引物，进行RT-PCR鉴定分析，以了解新疆南疆地区BVDV基因类型，为BVDV分子流行病学研究积累资料，并为其防控措施的制定提供参考依据。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料及细胞
2022年4月，在新疆南疆某规模化肉牛场，通过临床诊断、病理观察，BVDV胶体金抗原检测卡检测为BVDV阳性的犊牛，无菌采集其抗凝血样品，并及时送实验室。流行病学调查发现该场未免疫接种牛病毒性腹泻疫苗。MDBK细胞，塔里木大学动物医学实验室保存。
1.1.2 主要试剂
Foetal Bovine Serum, BI(Biological Industries)公司产品；RPMI-1640基础培养基，武汉普诺赛生物科技有限公司产品；高糖DMEM培养基，米鼠(西安)生物科技有限公司产品；胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚红),北京索莱宝科技有限公司产品；人外周血淋巴细胞分离液，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；病毒检测用RNA提取试剂盒，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，2×Tap PCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000,天根生化科技(北京)有限公司产品；Primescript One Step RT-PCR Kit, TaKaRa生物工程有限公司产品。
1.1.3 主要仪器
二氧化碳细胞培养箱(BC-J80),上海博讯实业有限公司；台式高速速冻离心机(3-18R),北京智杰方远科技有限公司；电泳仪(LF-600),北京龙方科技有限公司；梯度PCR仪(TC-5000),伯乐生命医学产品有限公司；全能型凝胶成像系统(FlourChem R),普诺森科技(北京)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 病料处理
BVDV阳性的抗凝血样品，按照“人外周血淋巴细胞分离液”说明书操作要求，分离获得淋巴细胞，在-20 ℃反复冻融3次后，用0.22 μm的滤器进行过滤，收获滤过液放置-20 ℃保存备用。
1.2.2 分离病毒
将1.2.1步骤的滤过液接种于单层致密的MDBK细胞，吸附2 h后，补加2% DMEM维持液继续培养。每隔24 h观察1次细胞病变情况，至96 h时置于-20 ℃反复冻融3次后低温保存。按照上述步骤将病毒盲传5代。
1.2.3 病毒RNA提取
按照“病毒检测用RNA提取试剂盒”说明书操作要求，提取收获的病毒液RNA并置于-80 ℃保存备用。
1.2.4 RT-PCR检测
BVDV的5′-UTR和Npro的特异性引物[6],由上海赛恒生物科技有限公司合成(表1)。
表1 引物序列
取上述细胞培养物上清，提取基因组，按照“PrimeScrip One Step RT-PCR Kit”操作说明书，进行一步法RT-PCR,反应体系：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL,2×1 Step Buffer 25 μL,上游、下游引物各1 μL,RNase Free ddH2O 11 μL,RNA模板10 μL,总体系50 μL。RT-PCR反应条件：50 ℃ 30 min; 94 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.2.5 目的片段凝胶回收与测序
PCR扩增产物进行凝胶电泳检测、目的片段纯化回收，送至上海赛恒生物科技有限公司测序。
1.2.6 序列分析及遗传进化分析
使用DNA Star软件对分离获得的毒株核苷酸序列与从NCBI的GenBank中发布BVDV参考株序列进行核苷酸同源性分析(表2和表3),使用MEGA7.0软件构建系统发育进化树。
表2 BVDV 5′-UTR参考毒株
2、结果
2.1 病毒的分离培养
处理的淋巴细胞分离液感染MDBK细胞，观察96 h, 细胞未出现拉丝、结网、皱缩等细胞病变现象，盲传5代后未出现细胞病变，各代细胞反复冻融3次，置-20 ℃保存备用。
2.2 RT-PCR结果
提取第5代细胞冻融液RNA,以BVDV 5′-UTR基因特异性引物进行RT-PCR扩增，出现预期目的片段，大小约292 bp(图1);以Npro基因特异性引物RT-PCR扩增，出现预期目的片段，大小约736 bp(图2)。
表3 BVDV Npro参考毒株
图1 5′-UTR基因RT-PCR扩增结果
2.3 BVDV 5′-UTR和Npro基因核苷酸同源性比较
以BVDV 5′-UTR、Npro引物扩增的测序结果在NCBI中进行Blast比对，检测样品均属于BVDV 1型，命名该非致细胞病变的BVDV为BL株。
以5′-UTR基因核苷酸序列比对分析，5′-UTR-BL和25个BVDV参考毒株核苷酸同源性比较(图3),与2010年中国兰州BVDV-10毒株(JX276547)间基因序列的核苷酸同源性为95.7%,同为BVDV-1m型，与其余参考毒株的BVDV-1型间基因序列的核苷酸同源性为83.9%～89.4%;与BVDV-2型中的中国NXWZ株(OM209991)、土耳其C62019株(ON401188)的2b型的之间基因序列的核苷酸同源性分别为73.7%和74.5%。
图2 Npro基因RT-PCR扩增结果
基于Npro基因核苷酸序列比对分析，Npro-BL与21个BVDV参考毒株核苷酸同源性比较(图4),与中国哈尔滨TY05(GU120258)和中国黑龙江TJ0801株(GU120262)之间基因序列的核苷酸同源性同为92.7%,并且同为BVDV-1m型，而与意大利SI/207/12株(LN515611)的1t型之间基因序列的核苷酸同源性为63.1%;而与其余BVDV-1型之间基因序列的核苷酸同源性为70.5%～84.8%。
2.4 BVDV 5′-UTR和Npro基因遗传进化树构建
以BVDV的5′-UTR和Npro基因核苷酸序列分别构建遗传进化树(图5和图6),5′-UTR-BL与BVDV-1m型的中国兰州BVDV-10毒株(JX276547)处在同一分支上，与韩国BVDV-8067株(KY499131)的BVDV-1o型、波兰48/08株(JN715036)的BVDV-1g型、土耳其Bor4株(OM223849)的BVDV-1f型亲缘关系较近。
Npro-BL与BVDV-1m型中的中国哈尔滨TY05毒株(GU120258)处在同一分支上，且与中国黑龙江TJ0801株(GU120262)的BVDV-1m型与BJ0702株(GU120260)的BVDV-1p型亲缘关系较近。
3、讨论
BVDV可引起牛感染并表现出多种临床症状，主要有流产、先天性缺陷、新生小牛死亡、肠炎、呼吸系统疾病、免疫抑制、消瘦、不孕症和乳腺炎等[7],严重危害养牛业健康发展。
BVDV感染具有全球分布的特点，Kadir Y等[8]调查表明，BVDV-1b是全球主要的亚基因型，其次是BVDV-1a亚型和BVDV-1c亚型，美洲、亚洲、欧洲主要以BVDV-1b亚型，澳大利亚主要为BVDV-1c亚型，在南非BVDV-1a亚型比其他亚基因型更频繁地被检测到。我国的多个省(直辖市、自治区)均有相关报道且BVDV基因亚型呈多样性，大多为BVDV-1型，包含1a、1b、1c、1d、1m、1q等亚型，同时也存在BVDV-2型感染情况[9]。2023年，牛杰等[10]基于中国知网、万方、维普、PubMed、ScienceDirect等数据库，对93篇BVDV相关文献进行了系统评价、Meta分析发现，在我国许多地区牛群中BVDV流行较广。
图3 BVDV 5′-UTR核苷酸同源性比较
图4 BVDV Npro核苷酸同源性比较
新疆无论是规模牛场的牛，还是散养户的牛，都存在BVDV感染的情况，且有多种基因型。2007年，郭燕[11]通过对检测样本与BVDV参考株遗传进化分析，只有1株为BVDV-1b, 其他不属于BVDV-1中的其他亚型。2014年至2015年，陈锐等[12]研究发现新疆部分散养户肉牛以BVDV-1q、BVDV-1f型感染为主。张坤[13]自2014年1月至2016年1月，对新疆北疆地区7个规模奶牛场1月龄内犊牛开展了病原学、分子流行病学调查，结果发现部分牛场感染率较高，以BVDV-1b亚型感染为主。2015年，王龙[14]通过对新疆南北疆不同地区牛场采集的样品进行RT-PCR检测，分离获得21株BVDV,其中2株BVDV-1b、15株BVDV-1未知亚型，还有4株BVDV-Ⅱ型，表明BVDV在新疆不同地区牛场存在一定程度的感染和发生。王青青等[15]在2015年到2016年期间，对来自新疆南疆地区部分规模奶牛场的样本通过实验室检测发现，该地区规模奶牛场普遍存在BVDV感染，且存在多种基因亚型，如BVDV-1c亚型、BVDV-1b、BVDV-2a亚型和BVDV-1未知亚型的。在2018年至2019年期间，朱广艺[16]对南疆地区某规模奶牛场开展BVDV净化过程中，检测到该场存在BVDV-1c型。2019年，赵玉宾[17]对来自新疆南疆地区几个规模养鹿场的样品开展了马鹿BVDV实验室检测，检测结果表明该地区部分养鹿场均有不同程度BVDV感染且存在BVDV-1c亚型。在新疆地区BVDV不仅感染牛群，同时在马鹿养殖场也检测到BVDV的感染，说明BVDV在新疆地区感染范围较广泛。
图5 BVDV 5′-UTR基因进化树
图6 BVDV Npro基因进化树
近年来，新疆南疆地区大量从我国东北地区、山东、山西、内蒙古等大量引入肉牛，外地牛的引进增加了BVDV传入的风险。本研究中，对新疆南疆地区某规模肉牛场BVDV检测、基因型分型鉴定，确定为BVDV-1m型，通过对该牛场调查发现该场从外地引入肉牛的记录，目前，很难确定该场BVDV的感染来源。
通过上述分析，BVDV自2007年在新疆地区报道以来，规模牛场、散养户的牛均有不同程度的感染，感染范围较广且存在多种基因亚型，因此，开展流行病学调查可以为疫苗选择提供重要的参考依据。
参考文献:
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[14]王龙,梁霄勇,季新成,等.新疆部分地区牛病毒性腹泻病毒的分离､鉴定及分子流行病学调查[J].新疆农业科学,2015,52(2):334-338.
[15]王青青,张迎春,崔鑫,等.新疆南疆牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定及分析[J].畜牧与兽医,2018,50(7):113-117.
基金资助:兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室项目(ELDC202304);兵团科技局现代农业科技攻关与成果转化计划项目(2016AC012);
文章来源:黄琴,陈红强,张怡淼,等.新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定[J].动物医学进展,2024,45(07):18-23.
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