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吴茱萸碱对特应性皮炎模型大鼠的治疗作用

2024-09-03 24 上传者：管理员

摘要：目的探讨吴茱萸碱(Evo)调节环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号通路对特应性皮炎(AD)模型大鼠的治疗作用。方法通过多次2,4-二硝基氯苯(DNCB)涂抹建立AD大鼠模型，随机分为AD组、Evo低剂量(Evo-L,5 mg/kg)组、Evo高剂量(Evo-H,10 mg/kg)组、Evo-H+H-89(5 mg/kg)组、地塞米松(0.1 mg/kg)组，并以正常大鼠为对照组，随后对各组大鼠皮损程度进行评分；腹部取血，检测血清中白细胞介素(IL)-4、cAMP、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平；收集皮损组织，检测皮损组织病理学变化、肥大细胞数量、组织中PKA/CREB相关蛋白表达以及IL-4、TNF-α mRNA表达。结果与对照组相比，AD组大鼠血清中cAMP水平、皮损组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达降低，皮损程度评分、IL-4、TNF-α水平、表皮厚度、肥大细胞数、皮损组织中IL-4、TNF-α mRNA表达增加(P<0.05);与AD组相比，Evo-L组、Evo-H组、地塞米松组大鼠血清中cAMP水平、皮损组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达增加，皮损程度评分、IL-4、TNF-α水平、表皮厚度、肥大细胞数、皮损组织中IL-4、TNF-α mRNA表达降低(P<0.05);与Evo-H组相比，与Evo-H+H-89组大鼠血清中cAMP水平、皮损组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达降低，皮损程度评分、IL-4、TNF-α水平、表皮厚度、肥大细胞数、皮损组织中IL-4、TNF-α mRNA表达增加(P<0.05)。结论 Evo调节cAMP/PKA/CREB信号通路抑制AD模型大鼠的炎性反应及病理损伤。

关键词：
cAMP/PKA/CREB信号通路
吴茱萸碱
慢性炎性皮肤病
炎性反应
特应性皮炎
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特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是常见的慢性炎性皮肤病，其特征是瘙痒和湿疹，严重影响患者的生活质量[1]。目前常用的治疗方法是对皮肤损伤进行抗炎治疗，如使用他克莫司、糖皮质激素等，尽管上述方法治疗能够缓解AD症状，减少炎性反应并防止病情恶化，但所带来的副作用如皮肤萎缩、形成条纹等，极大的限制了其长期使用。因此，寻找安全、有效的AD方案势在必行。吴茱萸碱(evodiamine, Evo)是吴茱萸的主要药用成分，其抗炎、抗心血管疾病被广泛研究。据报道，Evo可能对屋尘螨诱导的过敏性疾病如AD和鼻炎有效[2],但其机制尚未明确。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)调节细胞的各种生物过程，蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)是cAMP的主要目标，cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)是充分表征的PKA底物，调节细胞分化、增殖、凋亡。研究表明CREB可以启动多种细胞变化以响应激活，包括皮肤肥大细胞，而皮肤肥大细胞又是急性过敏中的关键效应细胞，可导致各种慢性皮肤病发生，如AD[3]。因此本研究推测Evo可能通过调节cAMP/PKA/CREB信号对AD大鼠发挥治疗作用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：

湖北省实验动物研究中心提供6周大的67只雄性SD大鼠，许可证号：SCXK鄂2020-0018,并在无特定的病原体条件下饲养，该实验获已获得动物护理和使用委员会的批准。

1.1.2 实验试剂与仪器：

吴茱萸碱(evodiamine, Evo)(纯度98%,批号190813)(沃特莱斯生物公司);2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)(Sigma-Aldrich公司);PKA抑制剂-H-89(MedChemExpress公司);地塞米松注射液(南华千牧生物科技有限公司);白细胞介素(interleukin, IL)-4以及cAMP、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技公司);PKA、CREB、GAPDH抗体(Abcam公司)。DSU3成像系统(Nikon公司);Multiskan FC型酶标仪(ThermoFisher Scientific公司);光学显微镜(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 AD大鼠模型的制备及干预：

AD大鼠模型参照文献[4]制备：将随机选取的55只大鼠麻醉，去除背部毛发，涂抹7% DNCB进行首次致敏；随后涂抹3% DNCB,涂抹频率为：每隔1 d涂抹1次，共3次，另选取12只仅脱毛的大鼠为对照组。当大鼠出现皮损、瘙痒、红斑以及结痂等症状，并选取2只大鼠对皮损部位进行组织染色，以确保AD大鼠造模成功。将造模成功的大鼠分为AD组、Evo低剂量(Evo-L,5 mg/kg)组、Evo高剂量(Evo-H,10 mg/kg)组、Evo-H+H-89(5 mg/kg)组、地塞米松(0.1 mg/kg)组，其中Evo-L组、Evo-H组按照上述给药剂量(由参考文献[5]和预实验结果确定)进行灌胃干预；Evo-H+H-89组以10 mg/kg Evo灌胃干预，同时腹腔注射5 mg/kg H-89干预[6];地塞米松组以腹腔注射0.1 mg/kg地塞米松干预[7],其余2组以0.9%氯化钠溶液干预，连续干预14 d, 每天给药1次。

1.2.2 皮损程度评分：

观察大鼠皮肤变化，以0～4分对大鼠特应性皮炎皮损程度进行评分[8](表1)。

表1 大鼠特应性皮炎皮损程度评分

1.2.3 ELISA检测血清中IL-4、cAMP、TNF-α水平：

从大鼠腹主动脉取血，血样以1 000×g的速度离心15 min, 收集血清，试剂盒检测IL-4、cAMP、TNF-α水平。

1.2.4 HE检测皮损组织病理学变化：

收集小鼠背部皮肤并在10%中性福尔马林中固定48 h。将组织包埋在石蜡中，切成4 μm厚的切片，在光学显微镜下观察大鼠背部皮肤病理组织学变化，并用Image J软件分析皮损组织炎性细胞浸润及表皮增厚情况。

1.2.5 甲苯胺蓝染色法检测肥大细胞数量：

将组织制成石蜡包埋切片，进行甲苯胺蓝染色，随机选取5个视野，统计真皮中的肥大细胞进行计数，其中肥大细胞呈现深蓝色。

1.2.6 Western blot检测组织中PKA/CREB相关蛋白表达：

在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中匀浆，用蛋白质测定试剂盒定量蛋白质。通过电泳分离蛋白质并转移到PVDF膜上。封闭膜，然后加入PKA、CREB一抗(稀释度为1∶1 000),在4 ℃将PVDF膜孵育过夜，TBST洗涤PVDF膜，加入二抗(稀释至1∶1 000),用TBST再次洗涤。最后加入显影剂，ImageJ进行蛋白质条带分析，所有目标蛋白质表达均以GAPDH为内参。

1.2.7 RT-qPCR检测皮损组织IL-4、TNF-α

mRNA表达：每50 mg皮损组织样品加入1 mL TRIzol试剂从匀浆的组织中提取RNA,并对提取的RNA样品进行逆转录，使用Exicycler 96实时PCR仪测量基因mRNA表达。PCR反应条件如下：95 ℃ 30 s(预变性);95 ℃ 5 s(变性),55 ℃ 10 s(退火),72 ℃ 15 s(延伸),共计40个循环。引物序列：IL-4正向：5′-ACCTTGCTGTCACCCTTC-3′,反向：5′-ACCTTGCT GTCACCCTGTTC-3′;TNF-α正向：5′-CTGATGAGAG GGAGGCCATT-3′,反向：5′-GCCTCTTCTCATTCCT GCTTG-3′;GAPDH正向：5′-ACTTTGGCATCGTGGA AGGG-3′,反向：5′-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3′;使用GAPDH作为内参对照，根据2-△△Ct方法计算每个靶基因的相对RNA表达水平。

1.3 统计学分析

实验数据以SPSS 25.0软件分析并用均数±标准差

表示，P<0.05时，差异有统计学意义。单因素方差分析用于多组间比较，以snk-q检验进一步两两比较。

2、结果

2.1 Evo对各组大鼠皮损程度评分的影响

与对照组相比，AD组大鼠皮损程度评分显著增加(P<0.05);与AD组相比，Evo-L组、Evo-H组、地塞米松组大鼠皮损程度评分显著降低，不同Evo间存在差异(P<0.05);与Evo-H组相比，与Evo-H+H-89组大鼠皮损程度评分显著增加(P<0.05)(表2)。

表2 比较各组大鼠皮损程度评分

2.2 Evo对大鼠血清中IL-4、cAMP、TNF-α水平的影响

与对照组相比，AD组大鼠血清中cAMP水平降低，IL-4、TNF-α增加(P<0.05);与AD组相比，Evo-L组、Evo-H组、地塞米松组大鼠血清中cAMP水平增加，IL-4、TNF-α降低，不同Evo间存在差异(P<0.05);与Evo-H组相比，与Evo-H+H-89组大鼠血清中cAMP水平降低，IL-4、TNF-α增加(P<0.05)(图1)。

2.3 Evo对大鼠皮损组织病理学的影响

对照组皮损组织无显著病理特征；与对照组相比，AD组皮肤出现溃疡，伴随大量炎性细胞浸润，表皮增厚(P<0.05);与AD组相比，Evo-L组、地塞米松组溃疡、炎性细胞浸润减少，病理损伤得到改善，表皮厚度降低(P<0.05);但Evo-H+H-89组溃疡、炎性细胞浸润较Evo-H组严重，表皮厚度较Evo-H组增加(P<0.05)(图2)。

图1 比较血清中IL-4、cAMP、TNF-α水平

图2 皮损组织病理学变化

2.4 Evo对大鼠肥大细胞数量的影响

与对照组相比，AD组肥大细胞数显著增加(P<0.05);与AD组相比，Evo-L组、Evo-H组、地塞米松组肥大细胞数显著降低，不同Evo间存在差异(P<0.05);与Evo-H组相比，与Evo-H+H-89组肥大细胞数显著增加(P<0.05)(图3)。

2.5 Evo对大鼠皮损组织PKA/CREB通路蛋白表达的影响

与对照组相比，AD组皮损组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达显著降低(P<0.05);与AD组相比，Evo-L组、Evo-H组、地塞米松组皮损组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达显著增加，不同Evo间存在差异(P<0.05);与Evo-H组相比，与Evo-H+H-89组皮损组织中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表达显著降低(P<0.05)(图4)。

2.6 Evo对大鼠皮损组织IL-4、TNF-α mRNA表达的影响

与对照组相比，AD组皮损组织中IL-4、TNF-α mRNA表达增加(P<0.05);与AD组相比，Evo-L组、Evo-H组、地塞米松组皮损组织中IL-4、TNF-α mRNA降低，不同Evo间存在差异(P<0.05);与Evo-H组相比，与Evo-H+H-89组皮损组织中IL-4、TNF-α mRNA表达增加(P<0.05)(图5)。

图3 肥大细胞数目变化

图4 皮损组织中PKA、CREB、p-PKA、p-CREB蛋白表达

图5 比较皮损组织中IL-4、TNF-α mRNA表达

3、讨论

AD是一种常见的慢性炎性皮肤病，以表皮增生、严重瘙痒、红斑和水肿为主要症状，由于疾病外观症状显著、易复发以及治疗费用高昂等，严重影响了患者的工作和生活[9]。因此寻找有效缓解皮炎症状且价格合理的AD治疗药物具有重要意义。

炎性反应的激活是AD皮肤损伤的关键机制，如T淋巴细胞活化可释放IL-4、TNF-α等炎性因子加重皮肤损伤；肥大细胞位于健康皮肤的真皮上层，当受到外部抗原或细菌刺激时会参与细胞因子的合成，如炎性反应因子，参与慢性炎性皮肤病的发生[10]。Evo作为一种生物碱，因其广泛的药用价值被人们熟知，尤其其抗炎活性。研究表明Evo可以抑制免疫细胞的激活进而抑制促炎细胞因子的分泌[11]。本研究发现Evo治疗后，AD大鼠症状及病理损伤得到缓解，炎性水平下降，肥大细胞数降低，表明Evo可以抑制AD大鼠炎性皮肤损伤，但其机制尚不明确。

在腺苷酸环化酶的催化，ATP可合成cAMP,PKA是其下游信号分子，CREB则是PKA的靶蛋白，该cAMP/PKA/CREB信号通路参与调节免疫、炎症等疾病的发展[12]。研究表明Crisaborole软膏作为新型PDE-4抑制剂，可以活化cAMP水平，进而激活cAMP/PKA/CREB信号通路，抑制炎性因子的产生，可有效穿透皮肤对中度特应性皮炎患者发挥作用[13]。本研究发现AD大鼠血清中cAMP水平现在降低，PKA、CREB磷酸化表达被抑制，大鼠出现AD症状及病理损伤，提示AD发生与cAMP/PKA/CREB被抑制有关。但经Evo干预后，明显提高了AD大鼠血清中cAMP水平，上调PKA、CREB磷酸化表达，炎性反应被抑制，AD症状及组织损伤被改善，推测Evo可能通过上调cAMP/PKA/CREB通路对AD大鼠发挥保护作用，为进一步验证实验推测，以cAMP抑制剂-H-89与Evo共同干预，结果显示H-89的加入抑制了cAMP、PKA、CREB水平，炎性反应加重，AD大鼠皮肤损伤加重，表明H-89逆转了Evo对AD大鼠的保护作用，表明Evo降低AD大鼠炎性反应，改善其病理损伤及特征，可能与上调cAMP/PKA/CREB通路有关。

综上所述，Evo可能通过调节cAMP/PKA/CREB通路降低AD大鼠炎性反应，减轻皮肤损伤，从而达到治疗AD的目的，为临床应用Evo提供可能，但由于机制及临床应用复杂，后续将深入研究。

参考文献:

[4]吴金环,郑宝勇,张理涛.紫草素对特应性皮炎小鼠TSLP/OX40L通路及Th1/Th2平衡的影响[J].天津医药,2021,49:949-954.

[5]王秀芳,孙瑞青,邓娟.吴茱萸碱对乙型肝炎大鼠肝损伤的影响及其机制[J].山西医科大学学报,2023,54:785-790.

[6]崇显瑾,杨历新.利拉鲁肽通过cAMP/PKA/CREB通路干预2型糖尿病大鼠骨质疏松的机制研究[J].中国病理生理杂志,2021,37:1949-1956.

[8]余何,张伟明,饶琪,等.玉屏风颗粒抑制肥大细胞及白细胞介素31缓解特应性皮炎大鼠的瘙痒症状[J].中药新药与临床药理,2022,33:1017-1024.

[12]郑亚娟,袁培培,傅阳,等.基于cAMP/PKA/CREB信号通路探讨麻黄生物碱组分对过敏性哮喘大鼠的抗炎机制[J].中药新药与临床药理,2022,33:1453-1459.

[13]朱翊,封宇飞.Crisaborole药理作用与临床评价[J].医药导报,2019,38:351-354.

基金资助:内蒙古医科大学青年创新基金(YKD2017QNCX050);

文章来源:蒋苏,吕新翔,崔艳红,等.吴茱萸碱对特应性皮炎模型大鼠的治疗作用[J].基础医学与临床,2024,44(09):1256-1262.