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ACKR1在尿路上皮膀胱癌组织中的表达及其与预后的相关性

2024-09-09 80 上传者：管理员

摘要：目的:探讨非典型趋化因子1(ACKR1)在尿路上皮膀胱癌(UBC)组织中的表达情况，并探讨其与预后的相关性。方法:收集428例UBC样本转录组基因表达数据进行差异基因分析并用ESTIMATE法进行肿瘤免疫微环境分析。随后，回顾性分析2019年1月至2021年12月我院泌尿外科收治的81例膀胱癌患者的临床资料，根据患者预后分为复发组(n=42)和未复发组(n=39),比较两组各临床特征的差异。采用免疫组织化学法检测组织中ACKR1表达情况，比较膀胱壁各层瘤内组织与瘤周组织ACKR1表达差异，并分析其与UBC患者临床病理特征的关系；采用乘积极限法(Kaplan-Meier)分析UBC患者预后状况，并采用Log-Rank检验进行显著性比较；采用Cox模型分析UBC患者不良预后的影响因素。结果:428例样本数据的差异表达基因分析发现ACKR1在肿瘤组织内表达下降并且与较低的免疫评分相关。81例UBC患者样本的IHC结果结合临床资料发现在未复发组中固有层瘤周组织的ACKR1表达量要高于复发组。另外，存在肿瘤细胞血管浸润者较不存在者的ACKR1表达量更低，且差异具有统计学意义。与ACKR1低表达组相比，ACKR1高表达组患者具有更长无复发生存期且P<0.001。单因素Cox回归分析表明分化级别、浸润深度、肿瘤大小、脉管浸润及ACKR1表达与患者复发相关；多因素Cox回归分析表明ACKR1表达为膀胱癌复发的独立影响因素(P<0.05),即与ACKR1低表达的患者相比，ACKR1高表达的患者复发风险较低(OR=0.032,95%CI:0.004 1～0.24,P<0.05)。结论:固有层瘤周组织内毛细血管内皮细胞表面的ACKR1低表达的患者可能倾向于较短的无复发生存期。

关键词：
ACKR1
肿瘤免疫微环境
膀胱癌
血管浸润
趋化因子
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尿路上皮膀胱癌(urothelial bladder cancer, UBC)作为最常见的恶性肿瘤之一，其高复发率以及高进展性的特性一直困扰着临床医生，并且其治疗也一直是临床和科学研究的焦点[1-3]。近年来，肿瘤免疫微环境的研究为癌症治疗提供了新的思路和策略[4]。趋化因子在调节肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用，而非典型化学因子受体1(ACKR1)作为趋化因子的调节因子，其在膀胱癌免疫微环境中的作用及其对患者预后的影响尚未得到充分的研究[5]。尽管当前多种治疗方法开发运用，在一定程度上降低了膀胱癌的复发，但仍有部分患者会复发，或表现出难治性或抗性，因此寻找新的治疗靶点和策略显得尤为重要[6-7]。本研究旨在探索ACKR1在膀胱癌中的作用，以期为膀胱癌的治疗和预后提供新的思路和可能的靶点。ACKR1主要分布于红细胞及毛细血管内皮细胞表面，可与多种趋化因子相互作用，协助趋化因子跨细胞运动及清除趋化因子[8-9]。通过对ACKR1在UBC免疫微环境中的调节作用研究，我们希望为临床治疗提供更为精准的个体化治疗策略，从而改善患者的预后和生存质量。

1、资料和方法

1.1研究对象

从我院病案室纳入2019年1月-2021年12月膀胱尿路上皮肿瘤患者。纳入标准包括：(1)病理诊断为尿路上皮癌；(2)患者采用手术治疗；(3)患者初次诊断时间在2019年1月至2021年12月。纳入人数为264人。排除标准：(1)合并非尿路上皮分化；(2)合并其他类型肿瘤；(3)行膀胱根治切除术；(4)患者病理标本太小或无法获得；(5)无法获取患者病例及预后信息。经过排除后最终纳入81人。患者预后信息通过电话形式进行随访。从患者入院日期到复发入院日期计算无复发生存期(recurrence-free survival, RFS)。该项研究通过我院临床研究伦理委员会的批准。

此外，从The Cancer Genome Atlas (TCGA)数据库，收集428例癌患者(403例UBC样本+25例正常组织样本)中转录组基因表达以及临床数据。

1.2免疫组化

从我院病理科调取福尔马林固定的、石蜡包裹的肿瘤样本。免疫组化方案简单概述为组织切片经过脱蜡和抗原暴露后，在保温箱内先后用抗-ACKR1(1∶500稀释，ab137044)和二抗(PV-6000)孵化，孵化后用DAB包显色，最后再用苏木精复染即可。

病理切片由资深的病理医师评估。每位患者病理样本在黏膜层、固有层和肌层部位血管较多处各采集5个高倍镜视野(0.5 mm直径)。组织样本小者，采集的视野可少于5个。用于Image J分析图像的放大倍数为×200倍。瘤周组织定义为邻近肿瘤组织的一个高倍镜视野内。间质定义为在肿瘤组织边缘的一个高倍镜视野外。切片不含肿瘤组织的排除。

1.3统计学分析

所有统计分析由R4.23软件进行。用limma包进行差异基因分析，用ESTIMATE包进行肿瘤微环境分析。通过受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线确定ACKR1高低表达的分界值。分类变量采用卡方检验或Fisher精确检验，连续变量采用Wilcoxon秩和检验，分析ACKR1与患者临床病理特征之间的相关性。乘积极限法(Kaplan-Meier)及Log-Rank检验分析患者预后状况。建立Cox比例风险回归模型，进行单因素和多因素分析。本研究中的以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ACKR1在尿路上皮膀胱癌组织内表达降低并且与较差的肿瘤免疫微环境相关

为了全面评估趋化因子受体在UBC中的作用，我们首先对428例UBC转录组基因表达数据进行差异基因分析，将其结果绘制成火山图(图1A),并在图中标出24个趋化因子受体(红色点)。最终发现只有ACKR1在膀胱尿路上皮癌组织内较正常膀胱组织呈低表达。

基于ACKR1可调控趋化因子，我们进一步分析ACKR1对UBC组织内免疫微环境的影响。我们采用ESTIMATE法从整体角度评估ACKR1对肿瘤免疫微环境的影响，并发现ACKR1高表达与更高的免疫评分相关(图1B),这表明在ACKR1高表达的肿瘤组织内免疫细胞浸润程度较高。

2.2患者基本临床特征

患者的基本临床特征见表1。纳入的患者大多数为男性(79.0%),并且年龄在65岁以下(40.7%),中位年龄为68岁(27～90岁)。患者病理分化级别主要为高级别(67.9%),浸润深度大多在固有层(37.0%),82.7%的患者未见脉管浸润。肿瘤直径≤3 cm占75.3%。然后，我们对患者的预后进行分析，发现患者复发与分化级别(P=0.004 4)、浸润深度(P=0.004 2)、肿瘤大小(P=0.033 2)及脉管浸润(P=0.012 6)有关。

2.3 ACKR1在尿路上皮膀胱癌组织毛细血管内皮细胞胞膜表达降低

通过镜下观察IHC结果(图2)发现ACKR1在多种组织结构都有所表达。主要有3处：红细胞和毛细血管内皮细胞胞膜以及肿瘤细胞的胞浆内。出于研究目的，我们凭借着IHC的定位及半定量分析特性，单独分析毛细血管内皮细胞胞膜表面的ACKR1。为了后述方便，除特殊说明明确部位ACKR1的表达都默认为是毛细血管内皮细胞胞膜上的ACKR1。

图1 ACKR1表达情况以及其对肿瘤免疫微环境的影响

表1 81例膀胱癌患者基本临床特征

2.4未复发患者固有层瘤周内皮细胞上ACKR1表达明显高于复发患者

将81名患者的病理样本按方法中介绍的，区分各部位毛细血管，并统计出各部位内ACKR1表达量。在瘤内组织中，ACKR1在各层表达量都下降，但各层之间无统计学差异。对于瘤周组织，我们发现ACKR1在固有层瘤周组织表达量高于肌层瘤周组织并且有统计学差异(图3A)。各层瘤周组织与整体瘤内组织的表达量对比发现，固有层瘤周组织上ACKR1表达量高于肿瘤组织内并且差异具有统计学意义(图3B)。

为了进一步探索膀胱肿瘤组织各部位ACKR1表达对患者预后的影响，我们将81例患者的病理样本按预后结果分为未复发组与复发组，将两组患者各部位ACKR1表达量进行统计学分析发现，未复发患者组的纤维血管轴心、固有层瘤周组织及固有层瘤内组织高于复发组并且具有统计学意义(图3C)。然而对于纤维血管轴心和固有层瘤内组织两组之间的OD值没有差异并且都成低表达(图3A)。

由于肿瘤细胞血管浸润可能在UBC复发过程中发挥重要的作用，我们进一步分析存在肿瘤细胞侵犯的血管内皮细胞上ACKR1表达情况，发现有肿瘤细胞侵犯的血管内皮细胞上ACKR1表达降低，甚至呈阴性表达(图2D)。将81例患者的病理样本分为脉管浸润组和无脉管浸润组进行统计分析，结果显示存在脉管浸润组ACKR1表达量明显低于无脉管浸润组肿瘤组织内的表达量且差异具有统计学意义(图3D)。

图2膀胱尿路上皮癌ACKR1阳性(SP×100 & 400)

图3 ACKR1在UBC样本各部位的表达量

2.5 ACKR1高表达与更长的无复发生存相关

ACKR1在固有层瘤周组织突出的差异表达促使着我们进一步寻求其与生存预后之间的相关性。用ROC曲线确定固有层瘤周组织ACKR1表达量的cutoff值(0.075 5),并以此将患者分为ACKR1高表达组及ACKR1低表达组。Kaplan-Meier曲线和Log-Rank检验结果显示在ACKR1高表达组患者的无复发生存(RFS)要明显长于ACKR1低表达组(图4),ACKR1低表达组患者中位RFS为10.7个月。

用单因素及多因素Cox回归分析评估影响尿路上皮膀胱癌患者预后的变量。单因素显示分化级别、浸润深度、肿瘤大小、脉管浸润及ACKR1与膀胱肿瘤无复发生存相关。多因素Cox回归显示ACKR1是影响膀胱肿瘤预后的独立危险因素(表2)。

3、讨论

目前已有多项研究表明ACKR1与肿瘤相关。SHEN等人通过构建ACKR1缺陷型前列腺癌小鼠模型，发现该模型小鼠的肿瘤组织内血管生成性趋化因子浓度升高以及血管密度增加，这些因素有利于前列腺癌生长及进展[10]。另外，在WANG等人的乳腺癌研究中发现ACKR1可清除血管生成性趋化因子，抑制肿瘤新血管生成而起到抑制肿瘤生长的作用[11]。然而据我们所知ACKR1与UBC相互关系的研究还没有报道。

图4 Kaplan-Meier生存曲线

表2 81例膀胱癌患者影响预后的单因素及多因素Cox回归分析

ACKR1的基因编码区位于染色体1q22-23,在哺乳动物中高度保守[12]。ACKR1主要表达于红细胞、毛细血管和毛细血管后静脉内皮细胞表面，还表达于浦肯野细胞上[13-14]。其可高亲和力选择性结合一些促炎和促血管生成的趋化因子，如白细胞介素-8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP1,CCL2)和黑色素瘤生长刺激活性-α(MGSA,CXCL1),但不结合稳态趋化因子或抗血管生成的ELR-趋化因子[15]。在本次研究中我们同样发现红细胞以及毛细血管内皮细胞上有ACKR1的表达，除此外还发现ACKR1在分化较低的尿路上皮癌肿瘤细胞胞浆内呈阳性表达。考虑到有研究表明非典型趋化因子(ACKRs)家族其他成员异常表达于肿瘤细胞并且与肿瘤发生发展相关。例如，ACKR3在膀胱癌、乳腺浸润性导管癌中发挥着促进肿瘤生长作用，另一方面ACKR2也可参与乳腺癌的肿瘤进展[16-18]。因此进一步探索膀胱尿路上皮肿瘤细胞胞浆内ACKR1对肿瘤的发生与发展作用，可能会成为一个具有前景的靶点。

我们的ESTIMATE结果发现ACKR1低表达样本与低免疫评分相关。这可能是因为毛细血管内皮上皮ACKR1低表达的样本组织对趋化因子转运能力降低，阻碍了肿瘤组织局部产生的趋化因子转运到血流中[19]。因此导致循环系统中的白细胞(包括T细胞，单核细胞，中性粒细胞等)招募到肿瘤组织部位减少[20]。

81例患者的生存分析结果表明ACKR1高表达患者的RFS明显长于ACKR1低表达者。这可能是因为ACKR1高表达的组织，可依赖ACKR1转运趋化因子能力并提高肿瘤组织局部产生的趋化因子的生物利用度，从而有利于各种抗肿瘤免疫细胞招募到肿瘤组织内并改善肿瘤免微环境，最终有利于提高患者RFS[8,21]。

另一方面，我们观察到存在肿瘤细胞血管浸润的毛细血管内皮细胞上，ACKR1表达量明显降低。有研究表明毛细血管内皮细胞上的ACKR1可以抑制肿瘤细胞远处转移，其机制为内皮细胞上的ACKR1可与肿瘤细胞表面的KAI1相互作用而调控TBX2和p21的表达，进而抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞衰老，此外还可限制肿瘤细胞远处转移[22]。因此ACKR1高表达可能有利于限制肿瘤远处转移而改善患者预后。除此之外，有研究表明趋化因子也与肿瘤细胞远处转移有关[23]。如CXCL12可通过作用于特异性受体CXCR4而激活多种信号通路促进膀胱癌增殖和转移[24]。低表达的ACKR1可能无法清除过多的趋化因子导致在肿瘤组织内聚集，从而诱发肿瘤细胞转移。这些通过血管隐匿性远处转移的肿瘤细胞是膀胱肿瘤切除术后再复发的主要来源[25-26]。

综上所述，我们通过本次研究发现固有层瘤周组织内毛细血管内皮细胞表面的ACKR1低表达可能与肿瘤免疫微环境的较低免疫评分和肿瘤细胞血管浸润有关，这些因素会导致患者的RFS缩短。

基金资助:2023年度太原市“六个一批”科研项目(重点项目)(编号:Z2023005);

文章来源:李如鹏,罗蓉,赵建,等.ACKR1在尿路上皮膀胱癌组织中的表达及其与预后的相关性[J].现代肿瘤医学,2024,32(20):3942-3947.