首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 膀胱癌论文 > 醛缩酶A对膀胱癌细胞生物学的影响及机制研究

醛缩酶A对膀胱癌细胞生物学的影响及机制研究

2025-02-24 51 上传者：管理员

摘要：目的探究醛缩酶A对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化(EMT)的影响及机制。方法通过慢病毒感染构建干扰或过表达醛缩酶A质粒并转染至T24人膀胱移行细胞癌(T24)细胞中，将细胞分为对照组、空载组、醛缩酶A干扰组和醛缩酶A过表达组。检测醛缩酶A在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达。检测细胞增殖、迁移和侵袭情况，同时检测EMT及Wnt/β-连环蛋白信号通路相关蛋白的表达。结果膀胱癌组织中醛缩酶A的免疫组织化学染色评分及相对表达量均高于癌旁组织[(33±7)分比(17±5)分、(63±6)%比(22±4)%](均P<0.001)。细胞计数盒8试验处理24、36和48 h后，醛缩酶A干扰组T24细胞吸光度值均低于空载组，而醛缩酶A过表达组T24细胞吸光度值均高于空载组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。醛缩酶A干扰组划痕愈合率低于空载组，醛缩酶A过表达组划痕愈合率高于空载组(均P<0.05)。醛缩酶A干扰组侵袭细胞数少于空载组，醛缩酶A过表达组侵袭细胞数多于空载组(均P<0.05)。醛缩酶A干扰组E-钙黏蛋白相对表达量高于空载组，神经钙黏蛋白、波形蛋白、β-连环蛋白、细胞周期素D1、c-Myc基因蛋白相对表达量均低于空载组(均P<0.05)。醛缩酶A过表达组E-钙黏蛋白相对表达量低于空载组，神经钙黏蛋白、波形蛋白、β-连环蛋白、细胞周期素D1、c-Myc基因蛋白相对表达量均高于空载组(均P<0.05)。结论醛缩酶A可促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,这可能是通过Wnt/β-连环蛋白信号通路发挥影响的。

关键词：
β-连环蛋白
上皮-间质转化
细胞增殖
膀胱癌
醛缩酶A
加入收藏

膀胱癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,其中90%以上为尿路上皮癌,具有多中心起源､易复发､易转移､耐药等生物学特征[1]｡吸烟､遗传因素和接触芳香胺被认为是导致膀胱癌的主要原因[2]｡约70%的膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌,这些患者通常需要多次经尿道膀胱切除术､高频膀胱输液化疗和强化膀胱镜随访,即便如此仍有30%~45%的患者在5年内进展为肌层浸润性或转移性膀胱癌[3]｡因此,研究膀胱癌发生和发展的生物学机制非常重要｡有氧糖酵解是肿瘤细胞在增殖､侵袭等恶性生物行为中主要能量供应方式,研究结果显示糖酵解过程中多种酶在肿瘤细胞中异常表达,具有致瘤性[4]｡醛缩酶A是糖酵解过程一种关键酶,其在肿瘤细胞和癌症患者的组织样本中高度表达,与多种肿瘤的发生和不良预后显著相关,包括前列腺癌､结肠癌和胃癌[4⁃6]｡然而目前关于醛缩酶A在膀胱癌中的研究较少｡本研究旨在观察醛缩酶A对膀胱癌细胞增殖､迁移､侵袭和上皮⁃间质转化(EMT)的影响及机制,为膀胱癌的临床治疗提供潜在的治疗靶点和理论依据｡

1、对象与方法

1.1对象膀胱癌组织和癌旁组织取自福建医科大学附属第二医院2019年12月至2021年12月收治的31例膀胱癌患者,其中男18例､女13例,年龄(62±8)岁､范围52~71岁,均未接受术前放疗或术前化疗｡所有标本的获取均获得福建医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准:[2020]福医附二伦理审字(77)号,标本的用途及患者权益均充分告知,患者均表示理解并签署了知情同意书｡

1.2主要试剂与仪器来源试剂:人正常膀胱上皮细胞(SV⁃HUC⁃1)及T24人膀胱移行细胞癌(T24)细胞购于中国科学院细胞库;McCoy′s5aMedium培养基购自美国Gibco公司;兔来源抗ALDOA购自成都正能生物技术有限责任公司;二氨基联苯胺购自北京中杉金桥生物技术有限公司;苏木精购自南京建成生物工程研究所有限公司;Lipofectamine2000购自美国ThermoFisher公司;抗体:甘油醛3⁃磷酸脱氢酶､E⁃钙黏蛋白､神经钙黏蛋白､波形蛋白､β⁃连环蛋白､细胞周期素D1､c⁃Myc基因蛋白､辣根过氧化氢酶标记的二抗(山羊抗兔)均购自美国Abcam公司;细胞计数盒8(CCK⁃8)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司｡

仪器:MCO⁃15AC⁃SC二氧化碳培养箱购自日本sanyo公司;RM2235切片机､HI1210展片烤片机购自德国Leica公司;垂直板电泳转移装置､Trans⁃Blot转膜装置购自美国Bio⁃Rad公司;Tannon⁃4200凝胶成像系统购自上海天能生命科学有限公司;多功能酶标仪购自美国ThermoFisher公司｡

1.3方法

1.3.1细胞培养及分组将T24细胞培养于含10%优质胎牛血清和1%青霉素⁃链霉素双抗的McCoy′s5aMedium培养基中,2~3d换液1次,细胞80%融合度时传代,可按照1∶3传代比例进行,于37℃､5%二氧化碳及饱和湿度培养箱中培养｡

1.3.2慢病毒感染及细胞分组过表达醛缩酶A载体构建:根据美国国立生物技术信息中心中人源醛缩酶A(基因ID:226,lclKR709337.1_cds_AKI69719.1_1)序列,利用全基因合成方法得到含有目的基因醛缩酶A序列的质粒;利用目的载体pLVX⁃mCMV⁃ZsGreen1⁃Puro构建含有醛缩酶A的过表达质粒载体,命名为pLVX⁃ALDOA｡醛缩酶A基因干扰载体构建:根据si醛缩酶A序列,设计聚合酶链反应引物扩增相应的干扰序列和阴性对照序列｡使用酶切载体pLV⁃shRNA⁃EGFP(2A)Puro构建含有siALDOA序列的质粒载体,命名为pLV⁃siALDOA｡将上述载体按照制造商的方案转染至T24细胞中,将细胞分为对照组､空载组､醛缩酶A过表达组､醛缩酶A干扰组｡对照组转染含有阴性对照序列的质粒;空载组仅加入转染剂Lip2000;醛缩酶A过表达组转染含有目的基因醛缩酶A序列的质粒;醛缩酶A干扰组转染含有目的基因醛缩酶A干扰序列的质粒｡

1.3.3免疫组织化学检测标本组织中醛缩酶A的表达组织标本经石蜡包埋后切片,按照常规要求进行免疫组化,二氨基联苯胺显色,苏木精复染,二甲苯封片｡每个样本的免疫组织化学染色评估得分基于染色强度得分与染色区域范围的乘积｡使用的抗体是醛缩酶A｡

1.3.4蛋白质印迹法检测重组细胞EMT和Wnt/β⁃连环蛋白信号通路标志蛋白收集各组重组T24细胞,按照放射免疫沉淀法裂解液说明书在冰上裂解30min,提取细胞的总蛋白｡用BCA蛋白定量试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度,制备蛋白样品｡每泳道30μg总蛋白样品上样,加入十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰氨凝胶电泳,分别以70和110V电压上层胶压线,下层胶分离｡根据预染蛋白的分子量获得目的蛋白所在区域凝胶,220mA､低温将目的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上,然后用5%脱脂奶粉封闭2h,洗涤后将聚偏二氟乙烯膜分别置于兔抗人上皮型钙黏蛋白单克隆抗体(1∶5000)､鼠抗人神经型钙黏蛋白单克隆抗体(1∶1000)､兔抗人波形蛋白单克隆抗体(1∶1000)､兔抗人β⁃连环蛋白单克隆抗体(1∶1000)､鼠抗人细胞周期素D1蛋白单克隆抗体(1∶1000)和兔抗人c⁃Myc基因蛋白单克隆抗体(1∶1000),4℃摇床上孵育过夜｡第2天加入二抗在室温下孵育1h,凝胶成像系统观察蛋白条带,采用ImageJ软件进行分析｡

1.3.5CCK⁃8试验转染24h后收集细胞,将细胞接种到96孔板中,每孔2×103个细胞,分别培养12､24､36､48和72h｡每孔加入10μlCCK⁃8溶液,避光､37℃培养1h｡用酶标仪检测细胞在450nm波长处的吸光度值｡

1.3.6细胞划痕试验待各组细胞生长到对数期,用10μl的枪头垂直沿着培养板背面的横线划痕｡磷酸盐缓冲液润洗细胞3次,加入无血清培养基｡继续放入培养箱中培养12h后观察并拍照｡

1.3.7细胞迁移/侵袭试验转染24h后收集细胞,用无血清培养基将细胞调整至2×104个/ml,吸取200μl细胞悬液加入上腔｡下腔加入500μl含20%胎牛血清的培养基｡37℃孵育24h后,从上腔轻轻取出细胞和Matrigel凝胶,用4%多聚甲醛固定30min,然后用结晶紫染色,在显微镜下拍照,计算中间和四周5个视野的细胞数,取平均值｡

1.4统计学方法基因表达数据经过对数转换和归一化处理后进行统计分析｡采用GraphPadPrism9统计软件分析和处理实验数据｡计量资料以x表示,2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析､而后的两两比较采用LSD法｡P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1醛缩酶A在膀胱癌组织中的表达膀胱癌组织中醛缩酶A的免疫组织化学染色评分及相对表达量均高于癌旁组织[(33±7)分比(17±5)分､(63±6)%比(22±4)%](t=5.427､9.381,均P<0.001)｡见图1｡

图1醛缩酶A在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达情况(免疫组织化学染色×100)

2.2醛缩酶A干扰或过表达对T24细胞增殖的影响CCK⁃8处理24､36和48h后,醛缩酶A干扰组T24细胞吸光度值均低于空载组,而醛缩酶A过表达组T24细胞吸光度值均高于空载组,差异均有统计学意义(均P<0.05)｡见表1｡

表1各组T24人膀胱移行细胞癌细胞细胞计数盒8处理后不同时点吸光度值比较

2.3醛缩酶A干扰或过表达对T24细胞迁移和侵袭的影响对照组､空载组､醛缩酶A干扰组及醛缩酶A过表达组的划痕愈合率分别为(52±4)%､(56±5)%､(44±5)%､(64±5)%,多组间比较差异有统计学意义(F=12.940,P=0.037)｡醛缩酶A干扰组划痕愈合率低于空载组,醛缩酶A过表达组划痕愈合率高于空载组(均P<0.05)｡对照组､空载组､醛缩酶A干扰组及醛缩酶A过表达组的侵袭细胞数分别为(41.6±3.8)､(40.8±2.3)､(20.4±3.0)､(61.2±6.1)个,多组间比较差异有统计学意义(F=18.570,P=0.021)｡醛缩酶A干扰组侵袭细胞数少于空载组,醛缩酶A过表达组侵袭细胞数多于空载组(均P<0.05)｡

2.4醛缩酶A干扰或过表达对T24细胞EMT及Wnt/β⁃连环蛋白信号通路的影响醛缩酶A干扰组E⁃钙黏蛋白相对表达量高于空载组,神经钙黏蛋白､波形蛋白､β⁃连环蛋白､细胞周期素D1､c⁃Myc基因蛋白相对表达量均低于空载组(均P<0.05)｡醛缩酶A过表达组E⁃钙黏蛋白相对表达量低于空载组,神经钙黏蛋白､波形蛋白､β⁃连环蛋白､细胞周期素D1､c⁃Myc基因蛋白相对表达量均高于空载组(均P<0.05)｡见表2｡

表2各组T24人膀胱移行细胞癌细胞上皮⁃间质转化及Wnt/β⁃连环蛋白信号通路相关蛋白相对表达量比较

3、讨论

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,因其具有多中心起源､易复发､易转移､耐药等生物学特征,膀胱癌发生和发展的生物学机制是目前关注的研究热点[7]｡醛缩酶A是一种糖酵解酶,其高表达与多种肿瘤的发生和不良预后显著相关[8]｡本研究结果显示醛缩酶A在膀胱癌组织中高表达,同时醛缩酶A通过Wnt/β⁃连环蛋白信号通路促进膀胱癌细胞的生物学行为,提示醛缩酶A具有改变Wnt/β⁃连环蛋白信号通路中的转录因子在调控膀胱癌细胞增殖､迁移､侵袭和EMT中的作用｡

转移是肿瘤发生的重要一步,可导致预后不良｡EMT作为调节肿瘤转移的主要参与者,可能参与肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用[9]｡EMT是指非运动性上皮细胞转变为具有侵袭能力的间充质表型的生物学过程,其特征是上皮表面标志物(如E⁃钙黏蛋白)的丧失和间质标志物(包括波形蛋白和神经钙黏蛋白)的增加[10]｡Jing等[11]研究表明,E⁃钙黏蛋白表达减少与肿瘤分化有关,并与膀胱尿路上皮癌患者预后复发呈显著正相关｡由CDH2基因编码的神经钙黏蛋白是一种对细胞黏附至关重要的跨膜蛋白[12]｡波形蛋白是一种中间丝蛋白,与包括膀胱癌在内的多种肿瘤类型患者的转移性疾病､预后差和生存率差有关[13⁃14]｡Ji等[15]发现醛缩酶A通过调节E⁃钙黏蛋白表达促进胰腺癌细胞增殖和转移,并预测胰腺癌患者的预后不佳｡本团队既往研究已发现在膀胱癌细胞中过表达醛缩酶A会增加细胞活力､集落形成率和侵袭细胞数量,此外还会下调E⁃钙黏蛋白水平,同时上调神经钙黏蛋白和波形蛋白水平[16]｡本研究结果表明,醛缩酶A过表达组的划痕修复能力､侵袭细胞数及神经钙黏蛋白､波形蛋白相对表达量均高于空载组,E⁃钙黏蛋白相对表达量低于空载组,而醛缩酶A干扰组的结果则相反｡这提示醛缩酶A通过改变关键的EMT标志物调节了膀胱癌细胞的EMT和迁移､侵袭｡

Wnt/β⁃连环蛋白信号通路参与了多个细胞过程,如发育过程中的增殖､分化､迁移､极化和自我更新[17]｡在这一途径中,β⁃连环蛋白累积后会进入细胞核,并与T细胞因子和淋巴增强因子1等转录因子家族成员相互作用[18]｡随后,这些转录因子刺激Wnt/β⁃连环蛋白靶基因的表达,包括编码C⁃Myc和细胞周期素D1基因｡细胞周期素D1在多种细胞代谢活动中至关重要,如线粒体活性调节､细胞增殖和生长调节､DNA修复和细胞迁移控制[19]｡研究发现细胞周期素D1的表达水平与膀胱癌的肿瘤分化､侵袭性生物学行为以及转移性疾病之间存在关联,凸显了细胞周期素D1作为预后参数的潜在作用[20]｡在大多数血液肿瘤和实体恶性肿瘤中,Myc家族的表达都会增加,这已被证明会增强肿瘤的生长和抗药性[21]｡Wnt/β⁃连环蛋白信号通路的持续激活通过EMT促进多种晚期癌症的进展和转移,并与不良预后显著相关[22⁃23]｡

综上所述,醛缩酶A在膀胱癌中高表达,具有促进膀胱癌细胞增殖､迁移､侵袭和EMT的作用,这可能是通过Wnt/β⁃连环蛋白信号通路介导的｡本研究存在一定的局限性:本研究仅进行了体外细胞实验,无法模拟醛缩酶A对T24细胞与肿瘤微环境的相互作用,后续考虑增加构建膀胱癌小鼠模型,对其调节膀胱癌的机制进行深入研究｡此外,不同类型的膀胱癌细胞也呈现了不同的特性,目前常用膀胱癌细胞株因其来源不同,醛缩酶A的表达各不相同,在后续实验中,应针对不同类型的膀胱癌采用不同细胞系进行细致深入研究,了解各个类型肿瘤的特点,才可找出更精准的治疗靶点｡

参考文献:

[23]叶丽静,李雨玲,曹卓.5⁃氟尿嘧啶联合奥沙利铂通过微小RNA⁃92a/Wnt/β⁃连环蛋白通路影响非小细胞肺癌细胞的顺铂耐药机制研究[J].中国医药,2024,19(12):1781⁃1785.

基金资助:福建省自然科学基金(2020J01206)~~;

文章来源:李建伟,蔡芳震,刘昌锦.醛缩酶A对膀胱癌细胞生物学的影响及机制研究[J].中国医药,2025,20(02):226-230.