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蓝湿革中三氯苯酚用漆酶去除的方法研究
摘要：研究了漆酶去除蓝湿革中三氯苯酚（TrCP）的可行性。采用常规的制革工艺，考察了温度、pH、酶用量、作用时间等条件下漆酶去除蓝湿革中TrCP的效果。结果表明，在pH=4.5、温度45℃、漆酶（268）用量0.1%，转动1h，蓝湿革中TrCP的去除率可达到90%以上，相同条件下未加入漆酶的对比实验中，TrCP去除率约70%。实验结果显示出漆酶在深度去除蓝湿革中的TrCP方面具有一定的效果。
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前言
三氯苯酚曾被广泛用于木材、皮革的防腐，同时也是农药、杀虫剂、杀菌剂的原料和许多工业合成的中间产物[1]。然而，三氯苯酚属于典型的氯代酚类污染物，持久性强，具有致癌性，并且能在生物体内富集和残留[2]。欧洲国家、美国及我国的环保部门均将三氯苯酚（2,4,6-三氯苯酚）列为环境水体中的优先控制污染物[3]，同时对日用消费品如鞋服类产品中三氯苯酚也明确提出限量要求，如国际生态纺织品标准（Okeo-TexStandard100）于2014年将三氯苯酚列为其限制物质（限值2mg/kg），有害化学物质零排放缔约品牌组织（ZDHC）于2016年将三氯苯酚列入皮革和纺织化学品中有害物质清单（含氯酚总量限值50mg/kg）。因此开展皮革及纺织品生产过程中三氯苯酚的污染控制技术研究，具有重要的现实意义。
蓝湿革是皮革加工过程的半成品，通常会经历较长的贮运周期。由于蓝湿革容易发霉[4]，因此蓝湿革中必须添加防腐剂以阻止霉变。三氯苯酚因具有良好的杀菌性能，曾被认为是防止蓝湿革霉变的最可靠的成份，其曾经作为防霉剂的组份添加到蓝湿革中[5]。然而蓝湿革中含有三氯苯酚在后续的染整加工过程中难以被去除，从而残留于成品皮革中，并导致皮革中三氯苯酚含量超标，对皮革的生态质量造成严重影响。因此蓝湿革中三氯苯酚的去除技术日益受到皮革行业的关注。
然而，针对蓝湿革中三氯苯酚的去除技术并无公开的文献报道。但因三氯苯酚在环境中存在的广泛性，关于环境样品中三氯苯酚的去除方法较多的研究，这些去除方法大致可归纳为物理化学法、化学还原法、化学氧化法及微生物法。其中微生物法是基于部分微生物及其分泌的酶所具有的脱氯或氧化能力，而实现三氯苯酚的转化和去除[6]。同时由于酶促反应基于水溶液中进行，因此操作方式可采用常规的蓝湿革的酶软化工艺，简便易行，这为蓝湿革中三氯苯酚的去除提供了可行的思路。
随着环保政策的日益严格，以蓝湿革为原料进行制革加工已成为今后我国制革工业发展的趋势。然而因蓝湿革来源的广泛性（不同国家、地区）以及三氯苯酚作为杀菌剂的高效性，企业采购的蓝湿革中可能会含有三氯苯酚。尽管目前无明确的数据证实蓝湿革中三氯苯酚浓度与最终成品革中三氯苯酚含量之间的关系，但蓝湿革中的三氯苯酚必然是成品革中三氯苯酚的来源之一。因此应该建立有效去除蓝湿革中三氯苯酚的方法，确保终端皮革的生态质量指标，避免因技术性贸易措施而导致的经济损失。基于此，本项目在借鉴酶法转化去除三氯苯酚的思路的基础上，并充分结合目前蓝湿革加工工艺，采用漆酶对蓝湿革中三氯苯酚的去除技术进行实验研究，对该方法的可行性进行探索。
1、实验部分
1.1仪器与材料
气相色谱仪，带电子捕获检测器：GC7890A（美国Agilent公司）；分光光度计：TU1810（北京普析通用仪器有限责任公司）；超声波发生器：KQ-500/40kHz（江苏昆山超声仪器厂）；真空旋转蒸发仪：RV10（德国IKA公司）。实验转鼓：直径0.4m及1m（无锡新达轻工机械有限公司）。
2,4,6-三氯苯酚标准品（CASNo.:88-06-2，纯度≥99%）：来自DrEhrenstorfer；甲醇为色谱纯，1-羟基苯并三唑（HBT）、2,2'-连氮基-双（3-乙基-苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；漆酶(268)由诺维信(中国)生物技术有限公司提供。其它试剂均为分析纯，分析实验用水为蒸馏水。
表1漆酶处理蓝湿革的工艺
2g/L的漆酶（268）溶液及1g/L的ABTS溶液均采用蒸馏水新鲜配制。所使用的含有TrCP的蓝湿革样品来自国内制革企业，均为牛皮蓝湿革。
1.2应用工艺
参照蓝湿革的酶软化[7]，根据表1中的工艺，采用漆酶对蓝湿革进行处理。
1.3温度和pH对酶活力影响的测定———ABTS法[8]
1.3.1温度的影响
准确移取pH=4.5、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液50mL，并预热至设定温度（25～60℃），然后依次向其中加入1mL的漆酶（268）溶液（2g/L）及1mL的ABTS溶液（1g/L），并在设定温度下放置2min；然后取适量溶液，快速测定420nm下吸光度。以未加入酶的样液作为参比样，一式三份，取平均值。
1.3.2pH的影响
分别准确移取pH=3.0、3.5、4.0、4.5及5.5，浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液50mL，并预热至45℃，然后依次向其中加入1mL的漆酶（268）溶液（2g/L）及1mL的ABTS溶液（1g/L），并在45℃下放置2min；然后取适量溶液，快速测定420nm下吸光度。以未加入酶的样液作为参比样，一式三份，取平均值。
1.4影响漆酶去除TrCP效果的实验
1.4.1温度
控制转鼓内浴液温度分别为40、45、50及55℃，调整转鼓浴液pH为5.0，加入蓝湿革质量0.1%的酶，转动1h，取样后检测蓝湿革中TrCP含量，考察温度对蓝湿革中TrCP去除效果的影响。
1.4.2pH
控制浴液的pH分别为4.0、4.5、5.0及5.5，控制转鼓浴液温度45℃，加入蓝湿革质量0.1%的酶后转动1h，取样后检测蓝湿革中TrCP含量，考察pH对蓝湿革中TrCP去除效果的影响。
1.4.3酶用量
控制转鼓浴液pH为5.0、温度为45℃，然后向转鼓中分别加入蓝湿革质量0.1%、0.2%及0.3%的漆酶，转动1h，取样后检测蓝湿革中TrCP含量，以未加酶、相同条件处理后的样品作为对比，考察漆酶用量对蓝湿革中TrCP去除效果的影响。
1.4.4作用时间
控制转鼓浴液pH为5.0、温度为45℃，加入蓝湿革质量0.1%的酶，然后在该条件下分别转动30、60、120及180min，取样后检测蓝湿革中TrCP含量，考察时间对蓝湿革中TrCP去除效果的影响。
1.4.5HBT用量
控制转鼓浴液pH为5.0、温度为45℃，分别向转鼓中添加蓝湿革质量0.05%、0.1%、0.2%及0.4%的HBT，然后加入蓝湿革质量0.1%的酶，转动1h，取样后检测蓝湿革中TrCP含量，考察HBT用量对蓝湿革中TrCP去除效果的影响。
1.5放大实验
基于优化的实验条件，在直径1m的转鼓中采用漆酶对中和后的蓝皮进行处理，进行放大实验，其中所用蓝湿革质量1.5kg，厚度1.1mm。然后取样检测蓝湿革中TrCP含量。
1.6蓝湿革中TrCP含量的测定
参照皮革中含氯苯酚的检测方法[9]，采用如下操作对实验中蓝湿革样品内的TrCP进行测定：将样品沥水至无水滴，然后置于烘箱中，于40℃下处理5h，至样品水份含量约30%；剪碎样品，准确称取2g，混入1g无水硫酸镁，装入100mL样品瓶中（能密封），加入20mL的乙腈后于超声波作用下萃取60min，冷却至室温后，取适量萃取液，膜过滤后采用带电子捕获检测器的气相色谱仪进行测定，计算结果以蓝湿革绝干重表示。所有实验样品一式三份，检测结果取平均值。
2、结果与讨论
2.1温度和pH对酶活力的影响
酶在应用过程中，容易受到外界环境（如温度、pH）的影响，只有在适宜的环境条件下，才能表现出最佳的性能，因此实验中首先对温度和pH对酶活力的影响情况进行考察。
图1温度对酶活力的影响（pH=4.5)
图2pH对酶活力的影响（45℃）
图1是温度对漆酶（268）活力的影响结果。从图中可见，在25～50℃范围内，随温度的升高，吸光度逐渐增加，表明被酶催化转化的ABTS量增大，即酶的活力增强。但当温度高于50℃后，吸光度逐渐降低，可能在于高温导致酶变性而活力降低。因此，可认为在40～55℃范围内，该酶具有较好的活力。
图2是pH对漆酶（268）活力的影响结果。该结果表明，在pH3.0～5.5范围内，酶活力先增大，然后逐渐降低；在pH4.5～5.5范围内，活力相对较高。因此可以认为该酶最佳活力的pH范围为4.5～5.5。
2.2温度和pH对酶法去除蓝湿革中TrCP效果的影响
基于温度和pH对酶活力的影响结果，实验中确定了转鼓实验时温度为40～55℃、pH为4.5～5.5。图3给出了温度对蓝湿革中TrCP的去除效果，从图中可见，当温度为40～55℃时，TrCP的去除效率随温度的升高而增加，但温度高于50℃时去除效果降低。该原因可能在于较低的温度下（40℃），活化的漆酶分子相对较少，酶促反应速率低；当温度逐渐升高时，活化的漆酶分子增多，使反应速率增大，因此TrCP的去除效果也逐渐增加；但当温度升高至一定的值，会导致酶出现热变性现象，而且随温度的继续升高，热变性变成主要影响因素，酶失去活力，这于图1中的现象基本一致。另外，较高的温度下对蓝湿革进行处理时，会导致纤维的过渡松散，会降低成品革的质量。基于此，实验中确定最佳的温度为45℃。
图3温度对酶去除TrCP效果的影响
图4pH对TrCP的去除效果的影响
图4为pH对漆酶去除蓝湿革中TrCP效果的影响。由图中可知，在pH5.0时的去除效果最好（去除率为93.4%），而且在pH=4.5～5.0范围内，TrCP的去除效果均良好（>90%），当pH大于5.0时，TrCP的去除效果逐渐降低（pH=5.5时为85%），这与文献[10]所认为的漆酶最适pH为4.0～4.5基本一致。原因可能在于pH不仅影响漆酶的活性，还影响TrCP在体系中的存在形态，同时漆酶与TrCP的结合受TrCP电离程度的影响，当pH逐渐升高时（pH>5.0),TrCP从分子状态逐渐转变为电离状态（酚氧负离子），而不易被漆酶催化转化。
漆酶在pH=4.5～5.0范围内对TrCP所表现出的良好去除效果，恰好与蓝湿革自身的pH以及中和工序pH相一致，这为漆酶效率的发挥提供了便利条件。因为该过程中不需要对体系的pH进行大幅调整，能有效地保证最终成品革质量。
2.3漆酶用量对蓝湿革中TrCP去除效果的影响
图5中考察了漆酶用量对TrCP的去除效果。从图中可见，在给定的pH、温度及转动时间下，随着漆酶用量的增加，TrCP的去除率逐渐增大。然而，当酶用量大于0.1%时，去除率增加不明显，这表明漆酶与底物作用时，随着酶浓度的增加，反应速率可能由一级反应向零级反应过渡，与已有文献[11]结论相一致。综合考虑去除效果和漆酶的成本，漆酶的用量控制为蓝湿革质量的0.1%为宜。
2.4时间对漆酶去除蓝湿革中TrCP效果的影响
图5漆酶用量对TrCP去除效果的影响
图6作用时间对酶去除TrCP效果的影响
图7HBT对漆酶去除TrCP效果的影响
图6中给出了作用时间对TrCP去除效果的影响。从图中可见，在设定的pH4.5、温度45℃、酶用量0.1%条件下，随转鼓转动时间的增加，TrCP的去除率先逐渐增加，然后基本保持不变，即1h后TrCP的去除率约93%,1.5h后的去除率为94%,2h后去除率仍然为94%。该原因可能在于随着时间的延长，酶分子向蓝湿革内部渗透程度的逐渐减弱。综合考虑去除效果和效率，转鼓转动时间控制为1h左右。
2.5HBT对漆酶去除TrCP效果的影响
文献[12,13]表明，漆酶催化转化底物过程中，可加入适量的HBT以提高漆酶的反应速率。该机理在于HBT是一种氧化还原介体，其与漆酶反应能产生高活性的氮氧自由基，从而加快底物的转化，利于转化效率提高。
然而，图7中的结果表明，转鼓中加入0.05%～0.4%的HBT后，TrCP的去除效果并未明显增加，与未加入HBT的去除率基本相同，这表明HBT在本体系中并无明显作用。原因可能在于转鼓内的溶液体系不利于HBT对漆酶的激活。同时考虑到HBT价格昂贵，应用后会导致成本的显著增加，因此可以不考虑加入HBT的方式来提高TrCP的去除效果。但基于HBT对漆酶的激活机理，可以选择其它低成本的材料来达到激活漆酶的效果，相关试验尚需要进一步深入。
2.6实际效果考察
基于上述实验结果，实验中确定漆酶（268）去除蓝湿革中TrCP最佳条件为：温度45℃、pH=4.5、酶用量0.1%、作用时间1h。然后在直径1m的试验转鼓中进行放大实验，对中和操作之前TrCP含量为7.5mg/kg的蓝湿革样品进行处理。两次重复实验结果表明，漆酶作用后的蓝湿革中TrCP含量分别为0.7mg/kg和0.6mg/kg，表明TrCP去除率在90%以上，与已有的小实验结果基本一致。而相同条件下未加入漆酶的对比样品中，TrCP含量为2.2mg/kg（去除率约70%），证实了漆酶的加入对TrCP的深度去除具有较好的效果。
3、结论
考察了漆酶对蓝湿革中三氯苯酚（TrCP）的去除效果。结果表明，在pH=4.5、温度45℃、漆酶268用量0.1%，转动1h，蓝湿革中TrCP的去除率可达到90%以上。实验条件下，激活剂HBT未显示出其对漆酶的激活效果。因实验条件的限制，本文中未能对TrCP经漆酶转化后的产物进行分析，未能阐述漆酶与TrCP作用的机理，相关研究有待于进一步深入。
参考文献：
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基金:2019年度国家级大学生创新训练计划项目(201910354010)
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2020-07-01我要评论
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