乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。2020年，中国女性乳腺癌新增病例约41.6万例，死亡病例超过11.7万例[1]。其70%以上为雌激素受体阳性(ER+),对于这部分患者使用内分泌治疗是常用策略，包括ER受体抑制剂、芳香化酶抑制剂，他莫昔芬是雌激素受体的竞争性抑制剂，被广泛用于乳腺癌和卵巢癌治疗并可有效提高ER阳性患者的生存率。但其耐药性是困扰临床应用的重要问题。多年来研究人员试图揭示他莫昔芬耐药产生机制并采用联合用药的办法来逆转耐药性的产生[2-3]。

ER(ESR1/ERα和ESR2/ERβ)是激素诱导转录因子核受体超家族的成员。雌激素属于胞内受体激素，可穿过细胞膜进入胞内，与细胞质中的ERα 或ERβ 结合，并发生构象变化，从而使得受体二聚化后进入细胞核，接着与雌激素反应元件(estrogen response elements, ERE)结合后，与辅激活因子形成具有转录活性的复合体，启动下游靶基因的转录，最终促进乳腺癌细胞的增殖和存活。然而经过内分泌治疗后的患者有20%会出现耐药性，原因包括ER突变[4-5]、某些信号通路的激活、ER基因DNA甲基化[6-7]等。

SHMT2(serine hydroxymethyltransferase 2)是丝氨酸羟甲基转移酶的两种转录本之一，主要表达于线粒体，但在细胞质和细胞核中也见表达，可催化丝氨酸转变为甘氨酸和N5,N10-亚甲基四氢叶酸的反应[8]。SHMT2已被发现在胃癌[9]、结肠癌[10]、口腔癌[11]、膀胱癌[12]等多种肿瘤中异常表达，其过表达与EMT[13]、放疗[14]或化疗耐性[15]有关。靶向SHMT2也被认为是一种有前景的治疗手段[16]。

本研究将对乳腺癌中SHMT2的表达情况及临床意义进行研究，分析SHMT2与雌激素受体ESR1间的相关性，并探讨联合靶向SHMT2和雌激素受体对ER阳性细胞系的影响，以期找到克服他莫昔芬耐药的方法。

1、材料与方法

1.1实验材料

乳腺癌细胞系MCF-7、T47D由本实验室保存；DMEM培养基、胰酶(Gibco,美国);青霉素-链霉素混合液(普诺赛，中国);他莫昔芬、SHIN2(MCE,美国);lipo2000转染试剂(Invitrogen,美国);胎牛血清、大肠埃希菌DH5α 感受态细胞、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(诺唯赞，中国);siSHMT2(吉玛基因，中国);Transwell小室(Corning Costar,美国);结晶紫染色液、RIPA细胞裂解液、PMSF(索莱宝，中国);蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国);质粒小抽试剂盒(天根，中国);羊血清、山羊抗兔IgG聚合物(中杉金桥，中国);DAB显色液(Biosharp,中国);SHMT2单克隆抗体(CST,美国);ESR1、β-actin、GAPDH单克隆抗体(Proteintech,中国);flag单克隆抗体、Dylight 680,Goat Anti Rabbit IgG、Dylight 800,Goat Anti Mouse IgG(Immunoway,美国)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及质粒转染

乳腺癌细胞系MCF-7和T47D均在37℃、5%CO2条件下，含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基中培养。在乳腺癌细胞生长进入对数期后，用lipo2000试剂转染siRNAs或过表达质粒(flag-SHMT2),培养48 h后进行后续实验。

1.2.2细胞迁移实验

将处理后不同组的细胞消化后用不含胎牛血清的DMEM培养基重悬，进行细胞计数，稀释细胞并调整其含量。在Transwell小室的下室加入约600μL含20%胎牛血清的DMEM培养基，将Transwell小室轻轻放入含培养基的下室中，在上室中加入100μL细胞悬液(即30 000个细胞),每组设置3个复孔，静置于CO2培养箱培养24 h。弃去培养基，用棉签轻轻旋转擦拭内侧面，去除上室未穿孔的细胞，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定15 min,结晶紫染色15 min, ddH2O冲洗后自然晾干。倒置显微镜观察并采集图像，每个小室随机选取5个视野，计算细胞数量并取平均值。

1.2.3平板克隆形成实验

收集处理后的细胞，500个细胞/2 mL/孔均匀铺种于6孔板中，每组设置3个复孔，静置于CO2培养箱培养一周，每2天换一次培养基。一周后弃去培养基，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定15 min,结晶紫染色15 min, ddH2O冲洗后自然晾干。拍照后利用Image-J软件计算细胞克隆数量并取平均值。

1.2.4 Western blot

在PBS清洗过的细胞中加入带PMSF的RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解30 min, 4℃、12 000 r/min离心10 min,取上清，BCA法测定蛋白浓度。蛋白定量后经SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,后与一抗4℃孵育过夜。经TBST洗涤后与二抗室温孵育1 h, TBST清洗，红色激光双色图像分析系统检测蛋白表达水平。

1.2.5总RNA提取、逆转录及实时荧光定量PCR

收集细胞，利用总RNA提取试剂盒提取总RNA,采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA,进行荧光定量PCR检测。引物序列见表1。实验数据用GraphPad Prism 6.0进行分析，使用2-ΔΔCt法计算各组基因的表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6免疫组织化学染色

将组织切片置于烤箱65℃加热3 h,后进行脱蜡和水化处理，将标本浸泡于柠檬酸缓冲液中，使用微波炉进行高温抗原修复，高火2 min,中低火10 min,冷却至室温。PBS清洗，滴加3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，室温孵育20 min。PBS清洗，羊血清37℃孵育30 min,一抗4℃孵育过夜。次日样本恢复至室温，PBS清洗后用山羊抗兔IgG聚合物室温孵育30 min。PBS清洗后，滴加DAB显色液，PBS终止显色，苏木精复染，1%盐酸酒精分色，温水反蓝。使用多级乙醇、二甲苯脱水透明，并用中性树脂进行封片。显微镜观察并采集图像。

1.2.7统计学分析

采用统计分析软件GraphPad Prism 6.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差

表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 SHMT2在乳腺癌中表达升高，并与预后不良相关

使用在线工具UALCAN(https: //ualcan.path.uab.edu/analysis.html)对TCGA(图1A)和CPTAC数据库(图1B)进行数据分析，发现乳腺癌组织中SHMT2的表达水平显著高于癌旁正常组织。K-M plotter(http: //kmplot.com/analysis/)绘制生存曲线发现，SHMT2高表达组的患者生存率显著低于SHMT2低表达组(图1C)。但进一步分析发现，在ER阴性的乳腺癌患者中，SHMT2高表达组与低表达组生存率无显著差异(图1D),而在ER阳性乳腺癌患者中，高表达组与低表达组间存在显著差异(图1E)。这些结果显示SHMT2高表达与乳腺癌的预后不良相关，提示其可能起到促癌作用。

图1 SHMT2在乳腺癌中表达升高，并与预后不良相关

2.2 SHMT2在乳腺癌中表达升高，其表达与ESR1呈负相关

接下来，应用免疫组化检测石蜡包埋的乳腺癌组织标本中SHMT2蛋白水平的表达情况。结果显示，与正常乳腺组织相比，乳腺癌组织中SHMT2表达显著升高(图2A)。使用GEPIA数据库(http: //gepia2.cancer-pku.cn/#correlation)分析发现，ESR1表达与SHMT2之间呈负相关(图2B)。

为明确SHMT2与ESR1间是否存在调控关系，在ER阳性细胞系T47D和MCF-7细胞中转染siSHMT2后，Western blot和荧光定量PCR检测结果显示，SHMT2的表达被显著下调，而ESR1的表达显著上调(图2C和D)。在T47D和MCF-7细胞中转染flag-SHMT2表达质粒后，Western blot结果显示，与flag组相比，SHMT2成功过表达，同时ESR1表达显著下调(图2E)。

2.3敲低SHMT2表达，提高他莫昔芬对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

为确定SHMT2或他莫昔芬对乳腺癌细胞的影响，采用细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况。如图3所示，用他莫昔芬(TAM,1μmol/L)处理或敲低SHMT2均能抑制MCF-7和T47D细胞的增殖能力，而在敲低SHMT2的同时加入他莫昔芬，抑制乳腺癌细胞增殖的作用进一步增强(图3)。

2.4 SHMT2抑制剂(SHIN2)提高他莫昔芬抑制乳腺癌细胞增殖的作用

SHIN2是SHMT1/2特异性小分子抑制剂，可抑制SHMT2相关功能。在T47D和MCF-7细胞中加入SHMT2抑制剂(SHIN2,2μmol/L),用他莫昔芬处理T47D-DMSO/T47D-SHIN2和MCF-7-DMSO/MCF-7-SHIN2细胞，细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果发现，与单独使用抑制剂或他莫昔芬处理相比，在SHIN2处理的细胞中加入他莫昔芬，抑制乳腺癌细胞增殖的作用更为显著(图4)。

2.5敲低SHMT2表达，提高他莫昔芬抑制乳腺癌细胞迁移的作用

为了进一步确定SHMT2敲低诱导的ESR1表达是否影响他莫昔芬对乳腺癌细胞迁移的作用，使用他莫昔芬处理T47D-siNC/T47D-siSHMT2和MCF-7-siNC/MCF-7-siSHMT2细胞，并用Transwell实验进行检测。结果发现，敲低SHMT2或用他莫昔芬处理均可显著降低乳腺癌细胞的迁移能力，但在敲低SHMT2的同时使用他莫昔芬处理，对乳腺癌细胞迁移的抑制作用最强，与其他组相比具有统计学意义(图5)。

2.6 SHMT2抑制剂提高他莫昔芬对乳腺癌细胞迁移的抑制作用

在T47D和MCF-7细胞中加入SHMT2抑制剂(SHIN2),用他莫昔芬处理T47D-DMSO/T47D-SHIN2和MCF-7-DMSO/MCF-7-SHIN2细胞，Transwell实验检测细胞迁移能力。结果发现，用SHIN2或他莫昔芬处理均可显著降低乳腺癌细胞的迁移能力，而同时应用SHIN2和他莫昔芬，可以进一步抑制乳腺癌细胞迁移，显示两者具有协同作用(图6)。

图2 SHMT2在乳腺癌中表达升高，其表达与ESR1负相关

图3敲低SHMT2表达，提高他莫昔芬抑制乳腺癌细胞增殖的作用

3、讨论

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，约占女性新发肿瘤的25%,虽然乳腺癌的治疗已经取得了重大的进步，但是死亡率仍然较高，开发更安全有效的治疗手段仍然十分迫切。

我们应用公共数据库分析发现SHMT2在mRNA水平上表达升高与患者预后不良相关，这与BERNHARDT等应用蛋白质组学方法分析的结果一致[17],其他学者[18-19]在各自的研究中也发现SHMT2高表达与乳腺癌的预后不良相关，但我们发现在ER表达阴性的肿瘤患者中，SHMT2表达与预后之间的关系并不密切，而在ER阳性的患者中则显著相关，因此我们推测SHMT2可能与ER之间存在调控关系，GEPIA数据库中的相关性分析初步佐证了我们的推测。我们进一步在细胞水平研究发现ER阳性细胞中敲低SHMT2后ESR1表达水平升高，如果用SHMT2抑制剂同样可以上调ESR1的表达，而过表达SHMT2后ESR1的表达则显著被下调。因此我们认为SHMT2调控ESR1的表达。

SHMT2是一种主要表达在线粒体内的氨基酸代谢酶，其表达上调或活性增强与核苷酸合成加速有关，而核苷酸合成是DNA或RNA合成的先决条件，对增殖旺盛的肿瘤细胞具有重要的意义。肿瘤细胞除生长速度加快外，代谢重编程也是其显著的特点，SHMT2的异常表达参与了mTOR信号相关调控[20],并与甲硫氨酸循环，氨基酸、糖代谢、脂代谢重编程等过程[21-22]相关。目前发现在大多数肿瘤中SHMT2异常高表达通常导致细胞周期加速[23]、凋亡减少[24]、运动及迁移能力增强[25]。据报道，SHMT2敲低可在体外诱导细胞凋亡，并抑制细胞活力、增殖和迁移能力[26-27]。在本研究中我们发现敲低或抑制SHMT2活性，明显抑制ER阳性乳腺癌细胞MCF-7和T47D的增殖与迁移能力。

图4靶向SHMT2抑制剂(SHIN2)提高他莫昔芬抑制细胞增殖的作用

图5敲低SHMT2表达，提高他莫昔芬抑制乳腺癌细胞迁移的作用(结晶紫染色)

图6靶向SHMT2抑制剂(SHIN2)提高他莫昔芬抑制细胞迁移的作用(结晶紫染色)

SHMT2还可以调控某些靶蛋白的表达，如最近发现其活性增加可致SAM含量升高，影响m6A甲基化修饰，从而使胞内某些mRNA甲基化修饰水平增加[28],增强mRNA的稳定性，使得靶蛋白的合成增多。另有研究发现，胞质表达的SHMT2可以与β-catenin相互作用，避免β-catenin的泛素化降解，激活Wnt信号途径，对肿瘤细胞生长增殖起到促进作用[29]。其代谢产生的一碳单位还参与了真核生物翻译起始所需的甲酰甲硫氨酰-tRNA的合成，因而可影响线粒体蛋白质合成的起始[30]。此外，SHMT2与SHMT1均被发现可以入核，参与dTMP的从头合成[31]。但SHMT2能否在细胞核内直接参与下游基因的转录调控未见报道，本研究结果显示，SHMT2敲低之后，细胞内ESR1的mRNA和蛋白表达都增高，说明SHMT2对ESR1的调控作用应该发生在基因水平或转录水平，但具体机制尚需要进一步的研究确认。

他莫昔芬用于ER受体阳性的乳腺癌患者内分泌治疗，其有效性已经被大量的临床数据证明，但治疗中对他莫昔芬耐药性的产生是其不利因素，国内外众多研究人员着力于扭转其耐药性，如POULARD发现，细胞核内的PRMT5表达可以作为乳腺癌他莫昔芬耐药的指标[32],而联合应用CDK4/6抑制剂等可以减弱耐药的产生[33]。有报道认为ERRα激活SHMT2转录，通过调节线粒体代谢适应增强乳腺癌对拉帕替尼的耐药性[34]。我们在研究中发现单独靶向或抑制SHMT2均具有较好的抑癌作用。在此基础上使用他莫昔芬比仅用他莫昔芬起到更好的抑制肿瘤细胞增殖和迁移的作用，因此SHMT2在乳腺癌细胞中高表达或许是他莫昔芬疗效不佳的原因，靶向SHMT2或许可为他莫昔芬治疗增效或逆转他莫昔芬耐药提供新的思路。

总之，本研究发现SHMT2在乳腺癌组织中表达显著增强，且与患者预后不良相关。特异性靶向SHMT2的siRNA和小分子抑制剂均可抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移，并可上调ESR1表达。因此靶向SHMT2同时使用SHMT2抑制剂将获得更好的抑制乳腺癌细胞增殖和迁移的效果。本研究结果显示SHMT2表达检测可用于乳腺癌患者预后和他莫昔芬治疗效果评价。

基金资助:国家自然科学基金(编号:81502536);山东省自然科学基金面上项目(编号:ZR2020MH218,ZR2023MH367);山东省大学生科技创新项目(编号:S202310440199,S202210440046);

文章来源:王璐伟,秘先霞,孔浩然,等.靶向SHMT2上调ESR1表达增强他莫昔芬的抗乳腺癌作用[J].现代肿瘤医学,2024,32(20):3834-3840.