乳腺癌(breast cancer, BC)为全球女性癌症相关死亡主因，2020年，全球BC确诊约230万例，约68.5万例女性死于该疾病[1]。BC发病率极高，死亡率亦显著[2]。BC因高度异质性、多因素影响和不可逆生物特性而备受关注。尽管有手术、放疗、化疗、靶向及内分泌治疗等多种措施，但BC的致死率未见明显下降。生物标志物为人体病理与生理状态指标，癌症中广泛应用。在BC早期诊断、预后及靶向治疗中广泛运用生物标志物，如ER、PR、Ki-67、p53、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)、程序性死亡受体/配体(programmed cell death protein 1/programmed cell death-ligand 1,PD-1/PD-L1)、免疫细胞等[3]。但BC复杂异质性导致诊治困难，且治疗正向个体化精准化发展，需更多生物监测指标支持。

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)家族包括8个亚型，在抗氧化反应中起着关键作用，是活性氧的重要清除剂，参与信号通路中过氧化氢的稳态。最初GPX酶家族分有两组，非标准氨基酸硒半胱氨酸(GPX1-4和GPX6)和半胱氨酸(GPX5、GPX7-8)。系统的发育分析进一步将该家族细分为三组，其中GPX4、GPX7和GPX8属于同一进化分支[4]。该家族的所有成员都受到了广泛的研究，具有很高的临床价值。例如过表达GPX1可降低体内外肿瘤的生长[5];GPX4参与铁死亡过程，影响癌细胞的耐药[6];GPX7参与了内质网中的蛋白质折叠[7];GPX7和GPX8在体内均与Ero1α相互作用，Ero1家族成员的主要作用是影响内质网中二硫键形成[8],从而影响氧化应激，影响BC患者的发病[9]。GPX8是该家族最后确认的成员[10],而对于新成员GPX8的研究比较匮乏，对GPX8的研究也越来越受到重视，GPX8被认为携带GPX家族的一个关键功能区域，是区分其他成员的重要特征。GPX8被认为是位于内质网(endoplasmic reticulum, ER)膜上的一种膜蛋白[7],通过防止过氧化氢的溢出来控制氧化还原状态。GPX8在多种肿瘤中已发现调控异常，包括胃癌、肺癌、 结肠癌等，KHATIB等[11]研究 发现了GPX8在BC组织的细胞浆中高表达，对通过(GPX8)/IL-6/STAT3轴影响细胞间基质，影响上皮细胞转化维持BC的侵袭性有关键作用。这些研究显示GPX8具有极大的研究价值，但对于其在BC中发挥的作用，我们仍然知之甚少，我们的研究通过生物信息数据库和免疫组化以及临床队列研究，分析了GPX8在BC患者中的表达水平、细胞定位和预后价值。

本研究通过TCGA的BC样本以及GEO数据库中的BC表达谱芯片数据集作为外部验证，探讨了GPX8基因及其甲基化位点与BC预后的关系。通过TIMER数据库分析了GPX8基因与免疫细胞浸润的关系。此外，我们利用BC临床队列及癌组织样本对生物信息学分析获得的结果基因进行验证。本研究旨在为BC的分子诊断及治疗提供新的参考依据。

1、资料与方法

1.1 生物信息数据库分析

1.1.1 数据获取

UCSC Xena数据库统合了迅速增加和零散的癌症基因组 学数据，其中包括了来源于 TCGA的癌症数据[12]。我们通过UCSC Xena数据库检索GDC-TCGA-Breast Cancer(BC)并在线下载相关数据集，包括基因表达RNAseq、DNA methylation、survival data、phenotype和干性评分(基于DNA甲基化和基于RNA值),其中包含了113个正常组织和1 105个肿瘤组织样本的基因信息，890个甲基化数据、1 260个生存数据和1 284个临床表型数据。此外，以“Breast Cancer”为关键词从GEO数据库检索BC基因表达谱数据集作为验证数据[13]。检索方法为：①时间自建库始至2023年03月01日的所有BC基因表达谱芯片；②组织来源为原发肿瘤；③条目类型为“Series”;④研究类型为“Expression profiling by array”;⑤Top Organisms选择“Homo sapiens”。通过下载的平台和系列矩阵文件作为TXT文件，最终选取了2个符合条件的基因表达谱数据集GSE42568和GSE61304。应用R语言的“Limma”程序包将拟研究基因GPX8的表达数据进行提取以进行针对性分析[14]。

1.1.2 GPX8基因的生存与表达分析

通过R语言探究在BC中的GPX8基因表达与临床预后信息的相关性。为可视化GPX8基因在不同疾病状态(肿瘤或正常)中的差异采用R语言“ggpubr”程序包绘制了箱式图，同时还应用“survival”和“survminer”两个R程序包分析了该基因差异表达的生存曲线，寻找该基因高低表达组与BC患者预后的关系。

1.1.3 免疫细胞浸润分析

TIMER应用了去卷积的统计方法，通过基因表达谱来推断肿瘤浸润性免疫细胞的数量[15]。我们通过TIMER算法评估了GPX8的表达与9种免疫细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、中性粒细胞、NK细胞、树突状细胞、M0、M1和M2巨噬细胞)丰度的相关性。

1.1.4 功能富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)

GSEA是一种用于确定预先定义的基因集是否两个生物状态之间差异存在一致性的计算方法[16]。在本次研究中，根据基因与GPX8表达水平的相关性预先生成了一个基因初始列表。这种计算方法阐明了我们观察到GPX8基因高表达组和低表达组之间的显著差异。对于每一次分析，我们执行了1 000次重复的基因集排列。我们提出的表型标记是GPX8的表达水平。此外，使用了nominal P-value和标准化富集分数(normalized enrichment score, NES)作为每个表型中的富集化途径分类依据[17]。错误发现率(false discovery rate, FDR)<0.05的基因集合被认为是显著富集的。

1.1.5 肿瘤微环境和干细胞指数分析

为预测肿瘤组织中间质与免疫细胞的渗透情况以及GPX8基因表达与RNAs和DNAs的相关性，我们使用“Estimate”和“Limma”R包来计算BC间质和免疫细胞评分，并采用Spearman方法分析GPX8与干细胞指数的关系，最后通过“corrplot”程序包可视化[18]。

1.1.6 临床队列采集及GPX8免疫组化与解释

BC组织包括Luminal A(LA) BC组织、Luminal B(LB) BC组织、HER-2过表达BC组织、三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)组织，所有病理组织都是术后标本，有清晰的病理诊断和完整的临床数据。BC患者均来自河北工程大学附属医院2014年至2015年期间治疗的患者，均接受根治术或根治性乳房切除术且未进行新辅助治疗，根据2013年第13届圣加伦国际乳腺癌会议，BC分为四种分子分型：LA、LB、HER-2过表达和三阴性。本研究经河北工程大学附属医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

在BC组织中进行GPX8标准免疫组化检测。组织样本由125个癌症样本组成并进行IHC分级方法评分，所有的数据均使用SPSS 26.0统计软件包进行统计分析。并采用配对样本t检验分析数据。免疫组织化学实验结果采用卡方检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

1.1.7 肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)的解释

根据乳腺癌国际免疫肿瘤学生物标志物工作小组的报告在BC病理标本的HE染色切片上评估肿瘤基质TILs[19]。在400倍放大倍数下评估单核炎性细胞占肿瘤基质面积的百分比，原位癌和挤压伪影等区域被排除。浸润性肿瘤细胞巢周围单核炎性细胞浸润与基质面积比例分别按>50%、10%～50%和<10%进行分类计算。>50%、10%～50%归为TILs阳性，<10%归为阴性。

1.2 随访方法

所有患者的随访通过河北工程大学附属医院门诊复诊、电话随访等进行。随访截止时间为2023年01月15日或者患者死亡日期。无病生存期为从最初病理诊断日期到BC相关事件日期、最后随访日期或死亡日期的时间。相关事件包括疾病复发、转移、新发或者死亡。

1.3 统计学方法

临床资料采用SPSS 26.0进行分析，统计数据用相对数来描述，并采用χ2检验进行比较。符合正态分布的数据用平均值±标准差表示。采用Kaplan-Meier曲线评价GPX8的预后价值。单因素分析采用χ2检验和Cox回归。在多因素分析中纳入Cox回归单因素分析中具有统计学意义的因素，并采用入组法。采用Cox回归分析危险比(hazard ratio, HR)和95%可信区间(confidence interval, CI)。双尾检验的显著性水准设为P<0.05。

2、结果

2.1 基于TCGA数据集GPX8表达和甲基化的临床与预后价值

对1 105例BC组织和113例正常组织的RNA测序数据进行分析，发现GPX8在BC组织中高表达，而在正常组织中低表达(图1A)。此外，图2A的生存分析发现GPX8表达与 肿瘤患者的预后相关(HR= 1.841 8,95%CI=1.307 1～2.595 2,P=0.034)。我们还观察到 GPX8表达与GPX8的DNA甲基化呈显著负相关(r=-0.1,P=0.004 6,图1B)。图1C中显示了3个GPX8 CpG位点的分布情况。为明确各GPX8 CpG甲基化位点与GPX8 mRNA表达是否存在密切联系，我们分别将三个不同位点cg14789272、cg05879418和cg08508814进行Pearson相关分析。如图1D-F所示，两个CpG位点(cg14789272 和cg08508814)的甲基化与GPX8的表达密切相关(P<0.05)。如图2B-C所示，我们选择了这些最相关的CpG位点以研究它们在BC患者中的预后价值。

2.2 基于GEO数据集的GPX8的预后价值验证

为了检验GPX8的预后意义，我们分析了GEO数据库两个 独立基因表达谱芯 片GSE42568(n=121)和GSE61304(n=54)的RNA测序数据。我们使用Kaplan-Meier分析 来研究与BC患者OS之间 的关系(图2D-E)。在GSE42568数据集(HR=4.024 8,95%CI:2.500 8～8.782 1,P<0.001)和GSE61304数据集(HR=2.835 5,95%CI:1.632 6～4.924 8,P<0.001)中，高GPX8预示着更差的OS,此结果与TCGA数据一致。

图1 不同类型样本中GPX8表达及甲基化分析   

图2 基于GPX8表达及甲基化水平的生存分析   

2.3 GSEA分析结果

在基于GPX8表达水平的GSEA分析中，GO和KEGG均显著富集(FDR<0.05,nom P值<0.05)。由于篇幅有限本研究只列出了部分与GPX8高表达和低表达相关的功能途径信息前5项GPX8高表达的GO和KEGG途径。在高表达表型中，ECM受体相互作用、焦点粘连、O聚糖生物合成、TGFβ信号通路、糖胺聚糖生物合成硫酸软骨素、肌动蛋白细胞骨架的调节等KEGG通路表现出显著富集；而在低表达表型中，以氮代谢、近端小管碳酸氢盐回收、甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢等信号通路显著富集。此外，在GPX8高表达表型中，GO生物过程(biological process, BP)主要与外部封装结构组织、蛋白聚糖代谢过程、上皮到间质的转变、结缔组织发育和蛋白质成熟调节有关；细胞成分(cellular component, CC)主要位于内质网、溶酶体和高尔基体的腔中，细胞外基质、细胞基质交界处，细胞膜和细胞器膜；分子功能(molecular function, MF)方面涉及金属肽酶、金属内肽酶和乙酰氨基半乳糖转移酶等多种生物酶活性，整合素、糖胺聚糖、G蛋白α亚单位、胶原结合、纤维连接蛋白等生物大分子的结合活性以及细胞外基质结构成分和结合。而在GPX8低表达表型中，主要与细胞线粒体的氧化呼吸链、氧化磷酸化、线粒体蛋白质定位、电子传输、蛋白质跨膜转运、乙酰辅酶a生物合成过程等生物过程有关，主要位于线粒体基质和线粒体内膜上，表现出多种酶活性、跨膜转运蛋白活性和构成核糖体。

2.4 免疫组化与临床队列研究

免疫组化结果显示：GPX8在乳腺组织的腺上皮细胞和肌上皮细胞中表达，阳性定位于细胞质和细胞膜(图3A-D)。GPX8蛋白在不同亚组中表达水平有所不同。在LA分型病例中阳性率为17.64%(6/34),LB分型病例为18.42%(7/38),HER-2过表达分型病例为36.00%(9/25),TNBC病例为50.00%(14/28),组间差异具有统计学意义(χ2=10.828,P=0.013);在TNBC组 中有更显著的表达 (χ2=7.909,P=0.005),见表1。

125例BC患者的平均年龄为54.7岁；随访期为8～60个月，平均随访时间为49.8个月。3年和5年生存率分别为80.8%和74.4%。随访结束时32例患者死亡，93例生存。Kaplan-Meier生存率分析表明，GPX8表达阳性的患者与阴性的患者相比，总生存率显著降低，提示GPX8的表达与BC高度相关(对数秩χ2=9.233,P=0.002 4,图3E)。在临床队列中，GPX8在TNBC分类BC中的 表达增强 (χ2=7.909,P=0.005,表1)。基于关联分析，不同TNM分期、T分期等级和分子亚型之间GPX8表达的差异具有统计学意义(χ2=7.518,P=0.028;χ2=12.534,P=0.006; χ2=10.828, P=0.013)。很遗憾根据关联分析，GPX8表达与TILs之间不相关(χ2=0.278,P=0.598,表1),但是在TNBC分组中我们发现GPX8表达与TILs之 间的差异具有统计学意义 (χ2=7.036,P=0.021,表2)。基于Cox回归模型的单因素分析，GPX8表达[HR=2.919,95%CI(1.456～5.850),P=0.003(表3)]被认为是总体死亡的显著预测因素。后经多因素分析，GPX8表达与Garding分期、TNM分期、T分期和淋巴结转移对总生存率无影响(P=0.485)。

图3 免疫组化染色检测显示GPX8蛋白在不同乳腺组织中的表达  

2.5 BC组织中GPX8表达与肿瘤微环境和干性评分的关 系

肿瘤微环境在促进疾病耐药、促进肿瘤进展和转移方面发挥了关键作用[20]。为探究GPX8基因在BC中的表达与肿瘤微环境的关系，我们使用ESTIMATE 算法计算BC组织的免疫和间质评分(图4A)。由图4A可知，GPX8表达在免疫、间质、评估方面呈显著的相关性，与RNAss和DNAss之间存在显著的负相关。

通过TIMER数据库，评估GPX8 mRNA表达与免疫细胞浸润的相关性。如图4B-C所示，外周血中GPX8的表达与 CD8+T细胞免疫(r= -0.139,P<0.000 1)、B细胞(r=-0.167,P<0.000 1)、NK细胞(r =-0.186,P<0.000 1)、Treg细胞(r=-0.127,P<0.000 1)浸润呈负相关，与中性粒细胞(r=0.093,P=0.000 318)、M2巨噬细胞(r=0.186,P<0.000 1)、Mast细胞(r=0.146,P<0.000 1)浸润呈正相关；但是未发现GPX8的 表达与CD4+T细胞 (r=0.02,P=0.534)、M1细胞(r=-0.059,P=0.061 3)的浸润有关。

表1 乳腺癌组织中GPX8表达与临床病理因素的相关性分析

表2 TNBC患者中GPX8和TILs统计关系的Fisher's精确检验n

表3 总生存期的单因素分析及临床病理因素的单因素分析

对TNBC患者的病理组织进行了免疫组化染色和HE染色，以观察GPX8表达强度和TILs水平之间的关系。结果显示，在相同的区域，GPX8的表达强度与TILs水平呈现负相关性(图5),即GPX8蛋白表达较高的区域，其周围TILs水平较低；而GPX8蛋白表达较低的区域，其周围TILs水平较高。这一验证结果支持了我们的猜想，在TNBC患者中GPX8和TILs表达水平呈现相反的趋势。

3、讨论

BC作为女性发病率极高的癌症[21],防治工作仍然是非常严峻的全球性问题。我们发现GPX8在BC的诊断和治疗指导中有重要作用，并且可作为诊断、预后的生物学标志物。

GPX8被认为是位于内质网膜上的一种膜蛋白，有研究者认为其可以通过过氧化物产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)来控制氧化还原状态，ROS的产生也与内质网应激有关[22],ROS在肿瘤中也作为信号分子，促进肿瘤细胞的生长、转移，肿瘤组织的血管生成和在某些类型的癌症中的分化阻滞[23]。我们的研究是GPX8首次在BC患者中的临床研究，首次证明其在TNBC中的高表达，并且探讨了其与TILs的关系。

从TCGA和GEO数据库获取了数据对GPX8进行分析，结果显示：TCGA数据库中GPX8在BC组织中高表达，且高表达者与更差的预后相关，这同KHATIB的研究相一致[11]。在GEO数据库同样得到了验证，在我们的5年随访的临床数据中，GPX8高表达组预后更差。在癌症中，DNA甲基化是表观遗传变化的一个关键机制。有研究表明DNA甲基化异常参与了多种类型的肿瘤发生[24]。肿瘤细胞的克隆类型由于基因突变、表达或甲基化的不同而不断变化[25]。我们也观察到GPX8表达与GPX8的DNA甲基化呈显著负相关，年龄、T分期等对预后影响较大的因素和GPX8甲基化关联密切，具有统计学意义。这与2022年一份研究中的结论相符[26]。

图4 GPX8与肿瘤免疫微环境相关性分析  

图5 在TNBC中用免疫组化染色检测GPX8蛋白表达和TILs水平   

我们通过GO、KEGG数据库中用GSEA初步分析了GPX8在BC中的生物学特征。高表达表型中，富集的通路主要涉及影响细胞外基质以及上皮间质转化，细胞外基质和上皮间质转化与BC的预后关系密切，特别是在TNBC[27]中。而GO生物过程(BP)与外部封装结构组织、蛋白聚糖代谢过程、上皮到间质的转变、结缔组织发育和蛋白质成熟调节有关；细胞成分(CC)主要位于内质网、溶酶体和高尔基体的腔中，细胞外基质、细胞基质交界处、细胞膜，这些结果预示着GPX8参与了细胞间基质转化，这与后期我们临床研究免疫组化的结果和TNBC中的高表达结果相符。

我们的实验发现GPX8表达位置在BC细胞的胞浆和胞膜中，且高表达与BC患者预后不良相关。这再次表明了GPX8可作为不良预后的预测因子，因此我们进行了具体的分析，对T分期、临床分期、组织学分级、肿瘤状态、肿瘤浸润淋巴细胞、患者生存等临床信息和病理诊断信息做了研究。结果符合我们的预期，GPX8阳性与患者预后负相关，尤其是在TNBC患者中表达更多，且与TNM分期、T分期、分子亚型相关。此外患者GPX8和TILs表达水平呈现负相关的关系，有研究者发现GPX8的表达在上皮间质转化程序中上调，它的缺失赋予了间充质样BC细胞MDA-MB-231的上皮特征[11],前期的生物信息学证据也提示了与细胞间机制和上皮间质转化的密切联系，这引起了我们的兴趣。

肿瘤细胞的克隆类型由于基因突变、表达或甲基化的不同而不断变化[25]。甲基化的分析证明其有意义，癌症干细胞有更新自己的能力，并可以产生异质性的肿瘤细胞，它们在肿瘤的生存、增殖、转移和复发中起着重要的作用[28]。我们再次分析了GPX8与肿瘤微环境和肿瘤干性的关系，GPX8表达在免疫、间质、评估方面呈显著的正相关，而与RNAss和DNAss之间存在显著的负相关。其中，DNAss是基于甲基化数据得到的干性指数，RNAss是基于表达数据计算得到的干性指数。当干细胞性指数接近于1时，细胞的分化程度趋于较低，而细胞的干性特征则变得更强。肿瘤微环境分析提示高表达GPX8象征着更高程度的间质细胞和免疫细胞浸润，此时肿瘤纯度更低，组织中的肿瘤细胞含量减少，而干性指数分析提示高表达的GPX8表示BC的肿瘤干细胞特征更低，肿瘤分化程度高。

我们在TIMER数据库发现很多与GPX8表达具有高度相关性的免疫细胞，同CD8+T细胞、B细胞、NK细胞呈现负相关，而CD8+T细胞有助于乳腺癌治疗的疗效[29],B细胞影响淋巴结转移及患者预后[30],在BC中NK细胞反映良好生存的能力，癌周组织中NK细胞的丰富度和部分晚期BC新辅助化疗的pCR率升高相关[31]。与中性粒细胞、M2巨噬细胞、Mast细胞浸润呈正相关，在既往的研究中有研究者发现肿瘤微环境中的中性粒细胞促进了BC的肺转移[32],M2巨噬细胞中的LAMs亚型主要分布在肿瘤-脂肪连接区域，高表达预示着BC的不良预后[33],BC周围组织中的肥大细胞参与肿瘤周围发生的炎症反应、分泌的血管生成细胞因子可以直接促进肿瘤血管化，促进BC的进展[34]。这些炎症介质可以招募或运输更多类型的炎症细胞到肿瘤微环境，从而加剧了恶性循环。关于GPX8对肿瘤浸润淋巴细胞的直接研究相对较少，而我们的实验在一定程度上验证了这个问题。我们观察到在TNBC患者的石蜡切片中二者表达水平呈现负相关的特征，结合富集分析的结果，我们有理由推测GPX8的高表达可能影响肿瘤细胞的氧化还原状态，从而影响肿瘤微环境的免疫细胞浸润，或可能参与调节肿瘤细胞的抗氧化防御，影响TILs对肿瘤的免疫反应。TNBC是目前预后较差的一种BC类型，免疫治疗被认为是其治疗的新希望[35,36,37],我们猜测GPX8的高表达有可能导致肿瘤免疫逃逸或抑制TILs的功能，继而影响BC患者对免疫治疗的敏感性和耐药的产生。这个发现为进一步研究GPX8在BC免疫治疗和预后方面的潜在作用提供了有益的线索。需要进一步探索GPX8与TILs之间的机制关系，以及其在TNBC治疗中的潜在临床应用价值。在未来的研究中我们实验组会把这个研究点作为重点去研究，在实验中深入研究其更加具体的相关机制。

我们的研究仍然存在一些问题，包括：临床数据不够充分、可能存在选择偏倚以及随访数据的丢失。还有我们的机制研究不够充分等，需要更多的临床数据和机制实验进行进一步研究。

综上所述，本研究显示GPX8 mRNA和蛋白在BC组织中表达上调，并与TNBC、免疫浸润、TNM分期、T分期和分子亚型相关。GPX8的表达与BC患者的不良预后相关，可作为诊断和预测预后的临床生物标志物。

参考文献:

[36]孙健健,魏敏杰.三阴性乳腺癌免疫治疗研究新进展[J].现代肿瘤医学,2017,25(7):1144-1147.

[37]董静,牛昆,庞丽然,等.免疫治疗相关单克隆抗体靶点在三阴性乳腺癌中的研究现状[J].现代肿瘤医学,2021,29(22):4044-4049.

基金资助:河北省自然科学基金(编号:H2021402015);

文章来源:李贺,赵艳春,韩建军等.GPX8在乳腺癌组织中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2024,32(05):848-856.