输血是临床治疗和急救的重要手段，其中RBC输注在临床上一直是患者治疗甚至挽救生命的重要手段之一[1]。全血采集分离后，RBC从体内循环进入血袋内，在体外储存[2]。在储存期间，RBC发生一系列结构、代谢和生物化学变化，这些变化随着时间的推移发生在堆积的RBC内，统称为储存损伤，与许多输血相关并发症有关[3-4]，其导致输注RBC的循环和功能下降[5]。临床回顾性研究发现，RBC的贮存时间与输血效果存在潜在负相关性，会降低临床输血治疗效果，甚至可能会导致严重输血不良事件的发生，这引起了人们对输血治疗中使用的储存血液的质量和疗效的极大关注[6-9]。近年来随着代谢组学[10]与蛋白组学[11]在输血医学领域的应用不断深入，为RBC不断累积的分子变化导致的贮存损伤提供了新的理解和研究视角，这有助于人们深入了解与RBC储存损伤过程中发生的事件。本论文旨在进一步明确悬浮RBC贮存过程中损伤的生化，蛋白组学和代谢组学变化情况及相关性分析，为研究悬浮RBC储存损伤积累更多科学依据。研究如下。

一、材料与方法

1 材料来源

血液保存全过程符合要求血液均来于自血液中心无偿献血者，年龄在18～60岁，所有献血者均按《献血者健康检查要求(GB18467-2011)》完成献血前健康征询和检查，均符合献血要求。

2 试剂和设备

血浆游离血红蛋白测定试剂盒(比色法)(北京瑞尔达生物科技有限公司，批号200629)；离子四项(日立仪器(苏州)有限公司，批号：J4574)；K+、Na+、Cl–浓度测定所使用的试剂包括参比电极液(日立，批号：L1656)、样本稀释液(日立，批号：K2321)、内部标准液(日立，批号：J4801)、钙离子检测试剂盒(和光，批号：205877)用于Ca2+浓度的测定、葡萄糖检测试剂盒(迈克，批号：0123011)、乳酸脱氢酶检测试剂盒(迈克，批号：221124)。

冷冻离心机(Thermo公司，Cryofuge6000i)、无菌接管机(Terumo公司，TSCD-Ⅱ)、全自动全血成分分离机(德国Lmb公司，Sepamatic-SL(Ⅲ))、WG-CZG低温操作柜(天津圣羊洁泰科技发展有限公司)、自动配平仪(YI CHUANG)、无菌接驳机(德国费森尤斯公司)、热合机(Sure Seal TUBESELER，型号SE250)、4 ℃储血冰箱、低温冰箱、超低温冰箱(海尔集团公司)、水浴箱(BWS-20，上海一恒)、血细胞计数仪(Sysmex，KX-21)，全自动生化分析仪(LABOSPECT 008 α，日立)、紫外分光光度计(T6，北京普析)，半自动生化分析仪(北京瑞尔达生物科技有限公司，photometer 4040)。

3 方法

3.1 溶血率

于检测当天从血袋中取出1 mL血样，取样前充分混匀血液。全自动血细胞分析仪检测血常规各项指标，然后离心取上清，按照游离血红蛋白检测试剂盒说明书测定悬浮RBC中血红蛋白含量。根据公式：RBC溶血率(%)=(1-RBC比容)×悬浮液游离血红蛋白浓度/总血红蛋白浓度×100%，计算储存期末的RBC溶血率。

3.2 生化指标测定

分别留取采集后不同时间点的悬浮RBC，通过低速离心机以3 500×g离心5 min后取上清液，使用全自动生化分析仪检测悬浮RBC的生化指标离子四项(Na+、K+、Cl-、Ca2+)、Glu(葡萄糖)及LDH(乳酸脱氢酶)等，具体操作参照试剂盒说明书。

3.3 扫描电镜

一定浓度RBC取出后PBS漂洗3次，加入戊二醛(2.5%)后于4 ℃固定过夜。固定后取出样品，复温30 min，PBS漂洗3次，梯度乙醇脱水：30%-50%-70%-80%-90%-95%(2次)-100%(2次)，每次5 min。随后用醋酸异戊酯置换无水乙醇(无水乙醇∶醋酸异戊酯=3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，0∶4)，每次5 min。吸水纸吸去多余液体后，将样品转移到干燥笼中，置于CO2临界点干燥仪中干燥。真空条件下给样品表面镀金。扫描电子显微镜下观察并进行图像采集。

3.4 蛋白组学

所得样品以3 500×g离心10 min，弃上清，然后用液氮冷冻。样品储存在‒80 ℃下以备使用。在实验中，获得同等重量的样品，每组重复3次，并委托上海美吉生物检测中心(上海美吉生物医药科技有限公司)使用采用与EASY-nLC 1200液相系统耦合Q ExactiveTMHF-X质谱仪进行LC-MS/MS分析。所有数据均上传到美吉云平台(cloud.majorbio.com)进行分析。采用R语言中的t.test函数计算组间差异显著性P值和差异倍数(Fold change,FC)。选择GO数据库(gene ontology,http://geneontology.org/)对所有的差异蛋白从生物学过程、细胞组分和分子功能三个方面进行GO注释分析功能聚类分析；采用KEGG(Kyoto encyclopedia of gene and genomes http://www.genome.jp/kegg//)通路数据库对差异蛋白涉及的代谢通路进行分析。蛋白质与蛋白质的相互作用分析是用String v11.5进行的。

3.5 液相色谱-质谱(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)非靶向代谢组学

所得样品以3 500×g离心10 min，弃上清，然后用液氮冷冻。样品储存在‒80 ℃下以备使用。在实验中，获得同等重量的样品，每组重复6次，并委托上海美吉生物检测中心(上海美吉生物医药科技有限公司)使用UHPLC液相色谱系统对制备的样品进行LC-MS非靶向代谢组学。上机完成之后，LC-MS 原始数据导入代谢组学处理软件 Progenesis QI(Waters Corporation,Milford,USA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，同时将MS和MSMS质谱信息与代谢公共数据库HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)以及美吉自建库进行匹配，得到代谢物信息。差异代谢物通过KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行的代谢通路注释，获得差异代谢物参与的通路。Python软件包scipy.stats进行通路富集分析，并通过Fisher精确检验获得与实验处理最相关的生物学途径。

4 统计学方法

使用Graphpad prism软件进行统计数据分析，计数资料以表示。多组间比较采用方差分析，以P<0.05表示有统计学意义。

二、结果

1 血红蛋白水平及溶血率检测结果(n=10)

悬浮RBC在储存期末的血红蛋白含量、血细胞比容、溶血率等所有质检指标全部符合《全血及成分血质量要求(GB18469)》，即血细胞比容(HCT)为0.569±0.031，血红蛋白水平为(193.5±10.28)g·L‒1，储存期末溶血率为(0.24±0.13)%。

2 生化指标检测结果

观察悬浮RBC不同储存时间血液样本中的生化指标发现，K+含量升高，其中储存第5周时K+含量(43.986±3.06) mM相比0周(6.621±1.272) mM增加了近7倍，差异具有统计学意义(F=1 272.631，P<0.01)(见图1A)。Na+含量随储存时间延长而下降，且第5周(100.03±4.994) mM与0周(125.72±10.841) mM相比，差异具有统计学意义(F=46.327，P<0.01)(图1B)。其中Cl-浓度和Ca2+浓度在储存期变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)(图1C，D)。葡萄糖(Glu)含量随储存时间延长而下降，且第5周(31.577±1.919) mM与0周(19.413±3.658) mM相比，差异具有统计学意义(F=86.724，P<0.01)(图1E)。LDH含量随着储存时间的延长而上升，其中储存第5周(1 126.7±351.117) U/L时，其含量与0周(169.4±71.036) U/L相比，差异具有统计学意义(F=71.412，P<0.01)(见图1F)。

3 研究采用扫描电子显微镜观察不同储存时间RBC表面形态学的变化

由图2所示，储存初期(Control0W)的RBC形态完整，中央凹陷较浅，表面较光滑，呈双凹圆盘形。经过储存35 d后(Control5W)的RBC发生变化，RBC表面出现皱褶、突起，可见细胞膜表面形成洞。

图1悬浮RBC保存期间各生化指标浓度的变化(n=10)

注：(A)悬浮RBC在不同保存时间的 K+浓度的变化(mM)；(B)悬浮RBC在不同保存时间的 Na+浓度的变化(mM)；(C)悬浮RBC在不同保存时间的Cl-浓度的变化(mM)；(D)悬浮RBC在不同保存时间的Ca2+浓度的变化(mM)；(E)悬浮RBC在不同保存时间的Glu浓度的变化(mM)；(F)悬浮RBC在不同保存时间的LDH浓度的变化(U/L)。注：储存期末5 周与0周比较**Ρ<0.01。

4 差异蛋白分析

对各个设定好的分组进行PCA分析，PCA分析图如图3-A所示。从主成分分析图中可以看出储存初期0周和储存期末5周之间蛋白组存在一定差异，但两组蛋白质成分也存在一定重合，储存期末组内差异较大。通过对悬浮RBC储存初期和储存期末的蛋白组学分析，一共鉴别得到了1 205个蛋白质，通过两组的筛选比对，我们找到52个差异蛋白质，其中上调21个，下调31个(图3-B)。为了从更为系统的层次和角度，对所研究的蛋白及其功能进行概括和分析，我们对筛选到的差异蛋白进行GO功能注释，然后通过Fisher精确检验方法对差异蛋白进行GO功能富集分析，通过GO分析可以将蛋白功能分为三类，第一类承担了分子功能，第二类主要生物过程中发挥作用，第三类在细胞成分中发挥作用。对样品中所有蛋白的GO注释结果分类图如图3-C所示，在Control0W和Control5W两组比较中，细胞结构组件、含蛋白质的复合物等分子功能，细胞过程、代谢过程、生物调节、定位、发育过程、对刺激的反应、多细胞生物过程等参与生物学过程，结合、催化活性、结构分子活性、分子功能调节活性、转运蛋白活性等细胞组分蛋白发生了显著变化。

图2扫描电子显微镜观察不同储存期RBC表面超微结构的变化

(A)对照组0周(Control0W)的悬浮RBC；(B)储存期末5周(Control5W)悬浮RBC。

图3对照组0周(Control0W)和储存期末5周(Control5W)样本之间不同蛋白组学的分析

注：(A)离子PCA得分图；注：样本间差异通过降维分析后，在主成分平面上有相对坐标点，各个样本点的距离代表了样本间的相似程度，距离越近表明样本间相似性越高。(B)差异蛋白火山图。注：图中的散点代表各个蛋白，灰色代表差异不显著的蛋白，红色代表上调蛋白，蓝色代表下调蛋白。(C)GO分类统计柱形图。注：图中每一个柱子表示一个GO的多级分类，柱条越高表示此多级分类的蛋白越多；纵坐标表示GO的多级分类术语，横坐标表示注释到该多级分类的差异蛋白的数目。(D)差异蛋白质KEGG通路富集分析。

在KEGG数据库中，KO(KEGG Orthology)是一个基因及其产物的分类体系。在同一条通路上具有相似功能的直系同源基因及其产物被归为一组，并赋予同一个KO标签。在生物体中，蛋白质并不独立行使功能，而是许多不同的蛋白质一起相互协同完成某一生物学功能，因此，通路分析可以更系统、全面地了解细胞的生物学过程。所以，我们对筛选到的差异蛋白进行了 KEGG通路富集分析，结果如图3-D所示。在比较组Control0W和Control5W中，吞噬体、朊病毒病、阿尔茨海默病、沙门氏菌感染、人乳头瘤病毒感染等重要蛋白通路发生显著变化。

5 差异代谢物分析

PCA分析是生物学中应用较为广泛的相关性分析方法，主要将样本中多个代谢产物的信息压缩为少量组件，以查找样本之间的关系，检测样本之间分组的趋势以及异常值[12]。因此，本研究选择PCA分析，根据各个样本代谢物的表达情况，评价各个样本组间的差异性与组内相似性。结果如图所示(图4A)，通过PCA得分图可以看出，组内样本相似性强，储存35 d后代谢产物有较大差异，不同组间样本较分散，表明该实验组内重复性好，组间差异性大，实验数据稳定可靠，可以用于进一步分析。使用火山图现了差异代谢物可视化，对照组(Control0W)和储存期末(Control5W)组共筛选了185种不同的代谢产物，其中62种代谢产物上调，123种代谢产物下调(图4B)。前30种不同表达代谢物的投影(VIP)分析中的变量重要性显示出相似的表达模式(图4C)。KEGG分析显示，不同代谢产物在各种途径中显著富集，包括核苷酸代谢、嘌呤代谢、亚油酸代谢、味觉转换、花生四烯酸代谢、辅因子的生物合成、FoxO信号通路(P<0.001)等(图4D)。

6 蛋白组学与代谢组学联合分析

比较蛋白组中蛋白参与的通路和代谢组中代谢物参与的通路，获得共同参与通路数38条(图5A)。富集分析方法通常是分析一组蛋白/代谢物在某个功能节点上是否出现过，原理是由单个蛋白/代谢物的注释分析发展为蛋白/代谢物集合的注释分析。富集分析提高了研究的可靠性，能够识别出与生物现象最相关的生物学过程。即，图中每个柱子代表一个KEGG通路，不同的颜色表示不同的组学，蓝色表示蛋白组，黄色表示代谢组。纵坐标文字表示通路的名称，横坐标表示通路富集的显著性，即P值，对P取对数，柱子越长，表明该生物学通路在所测样本中富集越显著。如图5B所示，血液储存期末，多种代谢相关生物学通路在所测样本中富集显著，如核苷酸代谢、嘌呤代谢及蛋白质的消化和吸收等代谢相关通路变化显著，即P>‒log10(0.05)，在所测样本中代谢相关蛋白通路变化不显著，即P<‒log10(0.05)。

三、讨论

图4对照组0周(Control0W)和储存期末5周(Control5W)样本之间不同代谢产物的分析

RBC是临床使用最多的血液制品，RBC的质量与多种输注并发症密切相关[13-14]。RBC经过0、1、3、5 W不同时间的保存，对制备的RBC制品质量控制相关指标进行观察。研究发现储存期末RBC各指标均未超过国家标准。有研究表明在储存期间，RBC发生生物化学和代谢改变。这些变化包括代谢产物的损失、RBC体积的损失伴随棘细胞形式的形成，RBC降解，以及无细胞血红蛋白、铁和细胞的释放碎片等[15]。有学者认为由于细胞中的K+含量比血浆中高数十甚至上百倍，在RBC保存期间随着RBC的破坏，RBC中的大量LDH以及K+将被释放人血，LDH和K+的含量可以反映RBC保存状态[16-17]。我们使用了常规实验方法检测了RBC储存质量和相关生化指标，证明RBC储存期末各指标未超国家标准，但还是有一定的损伤。我们的实验结果也显示，随着RBC储存时间的延长，其生化指标K+和LDH随着保存时间的延长而有所升高，Na+和Glu随着保存时间的延长而有所下降，在保存5周时差异具有统计学意义(P<0.05)，其它指标Cl-和Ca2+变化不明显(P>0.05)。同时实验使用扫描电镜显微镜观察RBC储存过程中其形态的变化，结果发现，经过储存35 d后的RBC形态发生了改变，RBC圆盘状消失，RBC表面出现皱褶、突起，可见细胞膜表面形成空洞。这些变化表明RBC在储存过程中确实随着储存时间的延长发生了损伤。后续我们又采用蛋白质组学和代谢组学技术进一步探究RBC储存损伤机制。

蛋白质组学(Proteomics)是指采用高通量、高灵敏的技术手段从整体上研究蛋白质的组成成分、表达水平及蛋白与蛋白的相互作用等。蛋白质组学研究在生物医学领域的应用对输血医学发展带来了巨大的推动，可以为血液制品的生物安全性提供新的质量评价指标[18-19]。虽然对于贮存RBC的蛋白质组学研究目前还仅限于学术研究，但近来越来越多的实验表明，蛋白质组学可成为贮存RBC质量控制监测的一项重要工具[20]。例如，膜转运蛋白对细胞稳态至关重要。

BRYK等研究首次提供了RBC膜中膜转运蛋白的全面定量数据集，确定了ABC转运蛋白家族的八个成员[21]。鉴于此，我们也对不同储存期RBC进行了蛋白组学相关研究，通过本次的研究结果发现RBC储存期末，细胞结构组件、含蛋白质的复合物等分子功能，细胞过程、代谢过程、生物调节、定位、发育过程、对刺激的反应、多细胞生物过程等参与生物学过程，结合、催化活性、结构分子活性、分子功能调节活性、转运蛋白活性及抗氧化活性ATP依赖性活性等细胞组分蛋白发生了显著变化。

图5蛋白组学与代谢组学联合分析

代谢组学是定性和定量分析在一定的生理期间特定的生物体或细胞内所有低分子量代谢物的一门新兴学科。非靶向代谢组学因其具有分析范围广、灵敏性高、定性分析可靠等优点成为生物样品分析中最常用的方法之一[22]。由于RBC不表达DNA，不转录RNA，也不合成蛋白质，但它们的代谢非常活跃。因此通过代谢组学检测RBC存储过程中代谢相关产物的改变来深入理解RBC的生理功能及存储损伤机制，为提高血液保存效果提供理论依据[19]。D'Alessan-dro等在AS-5保存的RBC中发现了348种代谢物，其中101种浓度增加，16种下降，231种保持不变。AS-5的腺嘌呤含量是SAGM的两倍，但是，在存储后期，上清液中的腺嘌呤也被消耗，其副产物次黄嘌呤显著增加。此外，上清中不仅发现谷氨酸和丙氨酸通过转氨基反应产生的副产物增多，而且其他三羧酸循环的中间产物如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等也在上清中增高。42 d时，除了蛋氨酸外，上清液中其他氨基酸水平均增加，同时，一些与丝氨酸代谢相关的中间体(丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸等)也相应增加[23]。也有研究指出，花生四烯酸代谢可能遵循多种相互关联的途径，导致多种炎症物质(缓激肽、血清素、组胺、前列腺素、细胞因子)的产生或释放[24]。在这里我们也研究了RBC不同储存期相关代谢物的变化情况，本研究发现RBC在存储期末，核苷酸代谢、嘌呤代谢、亚油酸代谢、味觉转换、花生四烯酸代谢、辅因子的生物合成、FoxO信号通路等代谢相关产物发生改变。同时进行了蛋白组学与代谢组学关联分析，发现悬浮RBC的储存期时间对RBC代谢过程影响更明显，特别是对核苷酸代谢、嘌呤代谢及蛋白质的消化和吸收等代谢，反而对RBC代谢相关蛋白的影响小一些。

综上所述，RBC保存过程中受外部环境和营养成分等变化的影响，对其相关蛋白及代谢具有重要影响，进而引起细胞内部分蛋白及代谢产物的组成发生改变，从而影响RBC的质量。因此，应用蛋白组学和代谢组学的研究成果我们可以对储存损伤机制进行深入研究，为进一步优化RBC的储存条件，减少RBC输注副作用提供了理论和实验基础。

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文章来源:苏晓敏,张国权,王锦,等.基于蛋白组学和代谢组学在血液存储中相关性分析[J].临床输血与检验,2024,26(05):609-616.