认知功能障碍（cognitive impairment,CI）是指包括注意力、记忆力、学习能力、语言能力等与大脑皮质有关的高级功能受损的一类疾病或症状，其致病因素较为复杂，包含神经退行性疾病、脑血管疾病和精神疾病，以及影响认知的药物（如阿片类药物）等[1]。认知功能障碍可能对患者的日常生活和工作能力产生严重影响，从而明显降低患者的生活质量。随着人口增长和社会老龄化的加剧，神经系统疾病高发年龄群体占总人口比例日益上升，神经系统疾病包括认知功能障碍在内的多种共患病也因此成为日益严重的全球性健康挑战[2]。

疾病动物模型在病理学的前瞻性研究、分子和细胞机制的探究以及临床生物标志物的验证等方面起到重要作用，而作为神经系统疾病的常见表现，认知障碍已成为近年来神经科学研究领域的热点，很多研究开始在动物模型上评价认知行为的变化[3]。其中，鼠类模型因其与人类基因水平高度同源、价格相对低廉且在生理学及遗传学方面研究深入等特点而被更多的研究者所选用[4]。本文总结了近年来不同研究者在鼠类模型上针对认知障碍的行为学评价方法，主要包括的方法有Morris水迷宫实验、Y迷宫实验、新物体识别实验等。

1、Morris水迷宫实验

Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）是由英国心理学家Morris设计并用于研究啮齿类动物空间学习和记忆能力的测试装置[5]。目前被广泛用于学习记忆能力、认知障碍、衰老等方面的研究，主要包括定位航行实验和空间探索实验两部分，是在鼠类模型中评估认知障碍最常用的行为学方法之一。

1.1 Morris水迷宫构建方法

MWM由圆形的水池、可移动位置并隐藏在水位以下（2～3 cm）的平台、图像自动采集处理系统组成，将水池划分为4个大小相等的象限并注入一定量的清水（见图1），加入某种不影响实验的物质以使水变得不透明从而将平台隐藏起来，并将水面的颜色和动物颜色区别开（不透明化可使用不同物质，如：奶粉、白色涂料、二氧化钛等）[6]。动物完成MWM实验需要一定的水温、光源及外界固定的参照物，其中水温影响实验结果的重要因素之一，水温过低会导致动物体力消耗过大，使其游泳能力变差或出现应激反应。

图1水迷宫示意图 

研究表明，在环境温度为19～22℃的水中进行测试的大鼠表现良好[7]。此外，MWM硬件设备应固定放置在光线均一、温度适宜且安静的环境中，以此减少外界环境干扰所引起的实验误差，保证实验结果的准确性。

1.2 Morris水迷宫操作方法

1.2.1定位航行实验

又称获得性训练，即将老鼠从不同象限的特定位置面向水箱壁放入水中，同时启动计时器或计算机跟踪程序，当老鼠到达（接触）平台时停止计时器并记录时间。另老鼠在规定时间内从特定位置来到达隐藏的平台（通常大鼠为2 min，小鼠为1 min），下一次试验开始之前使其在平台上休息10～20 s，进行重复操作，若超过规定时间未找到平台，则将老鼠引导至平台并使其在平台上同样休息10～20 s后再次进行实验。在整个实验过程中，若老鼠未充分休息再次跳入水中则需将其重新放回平台后重新计时。

每次试验后，需将老鼠用毛巾擦干并放入温度适宜的笼子中。实验每日4次，即4个不同的象限各1次，共连续训练3～6 d（取决于老鼠的种类以及实验设备的大小等）[8,9,10]。该实验的目的是使老鼠依靠空间记忆准确定位平台的位置，老鼠每一次入水后第一次成功找到平台所需的时间被称为逃避潜伏期，它的长短代表着老鼠空间学习记忆能力的好坏，潜伏期越短，预示着老鼠的学习记忆能力越好[11]。

1.2.2空间探索实验

一般在定位航行实验结束24 h后进行。需将原有平台装置拆除，选择一个不同于定位航行实验的入水点将老鼠面向池壁放入水中，记录老鼠在规定的时间内（一般为60 s）第一次跨越目标区域（原平台所在位置）的时间、跨越目标区域的次数等指标[12,13,14,15]。该实验的目的是评价老鼠的空间学习记忆能力，在一定的时间内，实验动物跨越目标区域的次数越多，说明其空间学习记忆能力越好。

1.3 Morris水迷宫的优缺点

1.3.1优点

MWM作为评估动物模型学习记忆的经典方法，实验原理清晰易懂，操作方法简单有效，同时MWM本身结构简明，搭建并不复杂。而且不同于伤害性刺激实验，MWM是利用动物对水厌恶的本能反应作为刺激，在一定程度上避免了实验动物受到伤害从而减少了由此引发的误差。并且对比很多干燥的迷宫，MWM的测试环境减少了气味干扰，使实验结果更加准确[16]。此外，MWM可以提供较多的实验参数，如逃避潜伏期、总路程、穿越平台次数等，能更加系统全面地反映受测动物的认知功能。

1.3.2缺点

MWM由于数据量庞大，且实验程序处理相对复杂，故对实验者的数据处理能力要求较高。同时，鉴于实验的精密性，MWM对实验室的条件要求较高，不但需要准备较好的监视系统及分析软件，还要求保持实验环境包括温度、声音，甚至时间等的一致。并且，因为进行MWM前需要对实验动物进行培训，所以无法满足一些要求短时间内得出结果的实验目的。此外，不是所有鼠类都适合MWM实验，由于实验对于鼠类的体力有所要求，故而一些年老体弱的鼠无法完成实验，而且一些鼠种由于皮肤病、视力、不会游泳等因素，同样不能完成该实验[17]。

2、Y迷宫实验

Y迷宫实验（Y-Maze）主要基于啮齿类动物天生的好奇心来实施，在没有正面或负面刺激的迷宫中，老鼠想要探索之前从未去过的区域，而具有良好空间记忆能力的老鼠会比其他老鼠更频繁地进入之前未被探索过的迷宫臂[18]。Y-Maze作为评估认知障碍动物模型的经典实验之一，被广泛用于认知功能减退、空间学习记忆等领域。

2.1 Y迷宫实验构建方法

Y-Maze大多由黑木或黑色有机玻璃制备[19]，主要由3条手臂组成，每条手臂之间的夹角为120°，臂长40 cm，宽15 cm，高30 cm左右（见图2）。实验者通过应用摄像机来观察记录老鼠的行为，以避免直接观察对实验结果带来偏倚。有研究表明，噪音可能增加动物的压力水平进而导致认知障碍，因此为保证实验的准确性，建议使用独立的房间并尽量减少设备噪声以排除环境干扰[20]。同时，气味也是常见的干扰因素，故应准备酒精纸巾等在测试前和测试之间清理迷宫，以减少实验误差，保证实验结果的准确性[21]。

图2 Y迷宫示意图 

3个手臂分别标记为A、B、C。

2.2 Y迷宫操作方法

Y-Maze可进行多种实验，其中以自发交替实验最为常见。实验开始前1 h左右将小鼠置于实验室，使其熟悉环境（包括实验人员、气味、噪音、温度、湿度等）。将Y-Maze的3个手臂分别标记为A、B、C。实验时，轻轻抓住老鼠尾部在其面朝迷宫中心时放入A臂末端，并开始录像记录，使其在不受干扰的情况下自由探索迷宫8 min左右后停止记录并保存录像。结束后将老鼠放回笼子，清理迷宫以消除嗅觉刺激，然后再选择下一只老鼠重复上述过程。在完成对所有实验老鼠的测试后，对视频记录进行分析，记录老鼠进入各区（当老鼠的后脚完全进入实验臂时才能判定为老鼠进入该实验臂）的次序和总次数（N），连续进入3个不同的臂即为1次正确交替反应，记录正确交替反应次数，并进行计算[22,23,24]。自发交替反应率（%）=[正确交替反应次数/（N-2）]×100%，该值越高，说明老鼠短期空间工作记忆能力越好。

2.3 Y迷宫的优缺点

2.3.1优点

Y-Maze作为测量动物模型学习记忆能力的一种经典实验，价格便宜，操作简单，而且得出的实验数据相对来说易于处理，对实验者及实验条件的要求较低[25]。同时，Y-Maze是一种不需要对动物模型进行学习训练或大量重复的实验，故有利于缩短实验时间、提高实验人员的工作效率、减少重复操作的疲劳感。此外，Y-Maze实验是基于老鼠自然探索的天性来实施，不需要其他正面或负面的刺激，因此大大减少了因这些潜在因素所可能导致的实验误差。

2.3.2缺点

由于Y-Maze在实验开始时不存在老鼠对迷宫环境的适应时间，所以老鼠表现出的活动减少可能与对新环境不适应而导致的焦虑有关，从而混淆实验结果。同时，有实验表明，一些因实验中的特殊处理而存在刻板行为或兴奋性运动的动物模型会显著干扰Y-Maze的实验结果[26,27]。并且作为一种干燥的迷宫，Y-Maze实验对设备的清洁度要求极高，任何一点气味刺激都可能使实验出现误差，故在测试前和测试之间需要严格清理迷宫。

3、新物体识别实验

新物体识别实验（novel object recognition test,NOR）是Ennaceur和Delacour于1988年设计的一种非奖赏性的、简单的认知记忆实验[28]。该模型基于啮齿类动物的先天探索行为设计，即当被测试动物未遗忘环境中见过的熟悉物体，便会选择用更多的时间探究未见过的新物体这一天性来评估实验动物的记忆能力[29]。目前该实验被广泛应用于脑科学相关的各个领域。

3.1新物体识别实验构建方法

新物体识别装置主要由一个测试盒和两套测试物体（新奇物体和熟悉物体）组成（见图3），测试盒以开口的矩形和方形常见，但也有相关研究表明，方形的测试盒可能使鼠类在角落里停留的时间显著增长，而圆形的测试盒则可能更有利于鼓励鼠类的探索行为[30]。对于测试物体的选择，则要求新奇物体和熟悉物体具有相似的复杂性（纹理、形状、颜色图案和亮度等），以减少任何可能导致结果偏差的潜在因素，但又要保证存在一定差异以让老鼠进行辨别。同时测试物体应足够重且结实，防止动物推动或受伤[31]。此外，测试环境要求在隔音、避光的场所，并在测试盒上方以白色光源照射以消除盒内阴影。

3.2新物体识别实验操作方法

NOR通常分为3个阶段：（1）适应期（见图3a），在没有任何物体的情况下让老鼠自由地搜查房间3～5 min，以适应新的环境。每只老鼠做完后要对测试盒进行清洁以去除气味；（2）训练期（见图3b），在适应期完成24 h后，将2个外观（形状、颜色和质地）相同的物体放置测试盒中，记录3～5 min内老鼠探索每个物体的时间；（3）测试期（见图3c），在训练期完成1～24 h后，将老鼠放回测试盒中，并在盒中放置一个新物体一个熟悉物体，分别记录3～5 min内动物探索两种物体的时间。老鼠的记忆能力可以用“分辨比”这一指标进行量化，“分辨比”一般用DR(dscrimination ratio,DR）表示，是由测试期实验时老鼠对新奇物体的探索时间和对熟悉物体的探索时间计算得到的，计算公式如下：DR=N/（N+F）（“N”表示测试期时老鼠对新奇物体的探索时间，“F”表示测试期时老鼠对熟悉物体的探索时间），DR值越大，老鼠的记忆能力越好[32,33]。

图3新物体识别实验示意图  

3.3新物体识别实验的优缺点

3.3.1优点

NOR相较于其他啮齿类动物记忆测验的主要优点在于它依赖于啮齿类动物探索新奇事物的自然倾向，因此不需要大量的培训或任何积极或消极的外部强化刺激来激励行为。且NOR周期较短，动物体力消耗小、动物几乎无中途脱失及死亡，避免了长时间训练可能导致的对动物的影响。此外，NOR可以通过改变训练与测试之间的时间以检查学习和记忆的不同阶段（如习得、巩固或回忆），评估不同类型的记忆（如短期记忆和长期记忆）。

3.3.2缺点

NOR的缺点在于，其往往需要相当大的样本量以达到统计学意义（通常15～20只小鼠/组），而且常常有2只或更多的小鼠由于在适应期和训练期缺乏充分的探索而不满足实验要求。此外，NOR不容易从基础的神经生物学角度解释，不同于其他一些可以归因于某一大脑区域的记忆测试，NOR可能同时与一些大脑区域和神经递质系统有关[34]。

4、其他方法

4.1常用实验

常用的评估认知障碍鼠类模型的方法还包括被动回避实验（passive avoidance test）、放射臂迷宫实验（radial arm maze,RAM）、巴恩斯迷宫实验（barnes maze）等。

4.1.1被动回避实验

是基于啮齿类动物喜暗恶光的天性所建立的，实验装置由明暗两室构成（见图4a），并在暗室下安装电击装置，当老鼠因喜暗的天性由明室移动到暗室时会受到电击令其返回明室，从而获得学习记忆，之后间隔24 h左右记录老鼠由明室进入暗室的间隔时间（潜伏期），潜伏期越长表示老鼠记忆和学习能力越好[35,36,37]。该实验操作简单，对实验环境要求较少，但易对实验模型造成伤害，影响实验结果。

4.1.2放射臂迷宫实验

装置由相同的呈放射状的8条臂和中央枢纽构成（见图4b），在实验开始前要限制老鼠饮食，再使其适应迷宫环境，并训练老鼠通过在迷宫内做出正确选择来获得食物，实验开始后，在随机的4个臂末端放入食物，并记录老鼠进入未放入食物的臂次数，次数越多，则认为其认知能力越差[38,39,40]。该实验对老鼠的伤害及体力消耗较小，但食物遗留气味等因素会对实验结果造成较大影响。

4.1.3巴恩斯迷宫实验

是利用老鼠避光喜暗、逃避噪音的习性设计的。实验装置由一个离地1 m左右的圆形平台构成，平台上均匀地分布20个洞口，其中1个洞口与下方的暗箱连接（见图4c）。实验前将老鼠放在平台中央使其自由探索5 min，后通过强光照射或噪声刺激迫使老鼠在规定时间内找到指定位置洞口下方的暗箱，并记录老鼠找到正确洞口的时间、进入错误洞口的时间及次数等数据用来评估老鼠的认知功能[41,42,43]。该实验操作简便，但在实验中老鼠有时缺乏探索迷宫的动力，如发现暗箱后没有进入，或在暗箱周围而没有进入，从而对实验结果造成影响。

图4常用实验示意图  

4.2最新研究进展

随着神经科学的不断发展，近年来，研究人员通过一些新的技术在原有理论方法的基础上改良创新，开发出了很多新的评估认知障碍鼠类模型的工具与方法，包括蜂窝迷宫实验（honeycomb maze）、变形迷宫实验（transformer maze）、可重构迷宫（reconfigurable maze）等，这些新的工具与方法不但弥补了经典实验的一些不足，同时也有着自身的特点及优势。

4.2.1蜂窝迷宫实验

蜂窝迷宫实验是对目前空间导航测试（如水迷宫实验）的重大改进[44]。实验要求老鼠学会从任何起始位置和任何方向接近空间中的1个位置，实验装置由37个镶嵌的可以独立升降的六边形平台组成（见图5a），在经过熟悉环境与限制饮食后开始实验。老鼠被放在一个升高的平台上，4 s后6个相邻平台中的2个被抬起，当老鼠在这2个平台中选择1个时，其他平台被放下，如此进行直到老鼠到达目标平台并给予奖励，最后通过老鼠在迷宫中的表现评估老鼠的认知功能。该实验通过在每个平台上给老鼠一个二元选择，弥补了水迷宫实验中较难对老鼠表现评分以及数据处理困难的缺点。但同时存在着操作复杂，装置造价相对较高等问题。

4.2.2变形迷宫

变形迷宫采用模块化设计，使实验者能够快速改变迷宫的路线和方向[45]。实验装置由9个方形隔间组成，每个隔间有实心的屏障和带有拱形开口的动物通道屏障，其中每个动物通道屏障分别被标记为白色与黑色（见图5b），老鼠选择白色屏障会通向死胡同，选择黑色屏障则会进入下一个隔间。实验以黑色为线索引导老鼠通向终点，最后通过分析老鼠在迷宫中花费的时间和行进的总距离来评估老鼠的认知功能。该实验的优点在于可以快速修改实验路线且实验动物受压力影响较小，缺点则在于该实验要求老鼠穿过拱形开口，因此无法使用任何连接老鼠头骨与外部设备的装置，如透析管或电生理线。

4.2.3可重构迷宫

可重构迷宫是一种可通过重新组装来进行不同实验的迷宫系统[46]。该迷宫由互锁的滑道和一系列随附部件组成（见图5c），允许实验人员以可重复和可扩展的方式快速灵活地配置各种迷宫结构，包括径向臂迷宫、T形迷宫、8字形迷宫等，解决了在同时应用多个评估方法评估老鼠认知功能时，各个方法之间由于准备环境的不同而使评估过程缺乏灵活性、可扩展性、可重复性的问题，然而该实验装置的初始成本和使用空间是其目前的局限性所在。

以上各种实验方法的实验装置、评价指标、优缺点及应用的比较（见表1）。

图5最新实验方法示意图

5、总结与展望

作为神经精神疾病中常见的表现之一，认知功能障碍是近年来神经科学领域研究的热点，本篇综述列举了一些经典的评估认知障碍鼠类模型的行为学方法，并从构建、操作以及优缺点等方面对这些实验进行了评估与讨论，同时介绍了一些在原有的理论方法基础上改良创新而开发出的新工具新方法，为神经系统的相关研究实验提供了参考。值得一提的是，虽然目前评估鼠类模型认知障碍的行为学方法较为成熟，有多种方法可供选择，然而所有的方法都有其局限性并且易受如老鼠的年龄、性别、品种等多种变量的影响，所以在评估认知障碍鼠类模型时，我们除了要联合应用多种方法取长补短，还应确定评估标准，以排除因老鼠性能不同导致的实验误差。同时，我们还可以结合人工智能和大数据分析技术，通过大数据的筛选与处理，对一些特殊的鼠类模型（如因实验要求而存在刻板印象或兴奋性运动的老鼠模型）进行专项的数据处理以尽可能减少对实验的影响，从而提高处理实验数据的效率与准确率；此外，虽然鼠类模型因其诸多优点而被广泛应用，但啮齿类动物的神经行为和高级的大脑功能与人类仍有很大不同，而随着目前虚拟现实（VR）技术在神经科学领域的引入，许多最初用于动物模型的任务现在可以转化为人类研究，这使得模型的跨物种比较逐渐成为可能[47]。借此浪潮，我们应该继续深化多学科联合的研究模式，加强神经科学领域的跨学科发展，从而开发出更加智能化的评价设备和分析方法，使我们可以通过评估认知障碍鼠类模型，来更好更准确地认识并治疗认知功能障碍。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：桑忱负责论文撰写；刘家琪负责文章检索及整理；王改青、李其富负责拟定写作思路、指导撰写论文并最后定稿。

表1 9种行为学评价方法  

参考文献:

[11]李思宇,李余霞,王庆松,等.三七总皂苷改善慢性脑低灌注大鼠认知障碍的行为学研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2020, 22(12):1316-1320.

[15]胡微澜,杨伟,韩威利,等.电针联合经颅磁刺激对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响[J].中国脑血管病杂志,2021, 18(7):458-464.

[25]6谢47晓9.露,陈秀,寇利秋,等. AD动物模型及其相关指标评价方法研究进展[J].中国比较医学杂志,2022,32(8):145-154.

[29]马舒贝,孙威,赵海苹,等. db/db小鼠远端大脑中动脉闭塞模型行为学评估方法的筛选[J].中国脑血管病杂志,2020, 17(9):520-530.

[31]尚培骏,姬乃春,杨锦雯,等.基于APP/PS1双转基因小鼠与野生型小鼠比较综述学习记忆相关行为学实验优缺点和注意事项[J].中国实验动物学报,2023,31(8):969-984.

基金资助:海南省重点研发计划(ZDYF2022SHFZ109);三亚市科技创新专项项目(2022KJCX24);

文章来源:桑忱,刘家琪,王改青,等.认知功能障碍鼠类模型的行为学评价方法:现状与展望[J].中风与神经疾病杂志,2024,41(05):395-401.