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猪流行性腹泻病毒S1基因遗传进化分析及蛋白结构预测

2024-11-13 366 上传者：管理员

摘要：猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科甲型冠状病毒属，可引起血清阴性新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水，死亡率较高。PEDV感染引起的猪流行性腹泻（PED）给欧洲和亚洲养猪业造成了重大的经济损失。地方性PED是一个重大问题，多种PEDV潜在输入或变体的出现加剧了这一问题。为了解PEDV的流行与变异情况，应用生物信息学方法对50个PEDV毒株进行了遗传进化分析。结果表明，不同基因型PEDV S1基因具有稳定突变点，同一地域主要流行毒株具有相对遗传稳定性，2020年后我国流行毒株多为G2c基因群。本研究为进一步监测和分析我国猪群腹泻的流行病学及研究PEDV的遗传变异规律提供参考，同时为PED的防控和疫苗研发提供理论依据。

关键词：
S1基因
猪流行性腹泻病毒
生物信息学
蛋白结构
遗传进化
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从20世纪80年代初开始，猪流行性腹泻（PED）在我国传播并流行[1]。PED是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的传染性极强的猪肠道疾病。该病毒可影响所有品种和年龄的猪，并使其表现出不同程度的症状。其中，仔猪感染的死亡率高达100%，临床症状为急性衰弱性腹泻、呕吐和脱水[2]。2020年以来，PEDV G2c毒株逐渐席卷全球养猪业，造成了巨大的经济损失。病毒的危害性如此之大，与其强大的传播力密不可分。通常，PEDV的主要传播途径是粪口传播，但粪鼻传播（空气传播）途径可能对PEDV在猪与猪之间和农场与农场之间的传播起重要作用[3]。PEDV一般先感染猪肠上皮细胞，然后定植于肠道，导致肠绒毛萎缩、坏死与脱落，影响猪只对营养物质的吸收，导致其呕吐、腹泻、体重减轻、厌食和抑郁[4-5]。当PEDV随粪便排出并进入环境时，被污染的粪便可能导致大规模流行。从母猪乳汁中获得足够的母源抗体是保护新生仔猪免受PEDV感染最有效的策略[6]。由于PEDV基因组的持续突变[7]，诱导黏膜免疫的效果较差，所以目前尚无有效的疫苗问世。因此，迫切需要深入研究该病原体遗传进化，并基于流行毒株快速开发有效的疫苗。

1、材料与方法

1.1 PEDV生物学特性

PEDV是一种包膜病毒，具有单链阳性RNA基因组，属于尼多病毒目冠状病毒科甲型冠状病毒属。PEDV基因组约28 kb，排列顺序为5'非翻译区（5'UTR）、开放阅读框1a/b(orf1ab）、纤突糖蛋白（spike glycoprotein,S）、辅助蛋白（ORF3）、包膜蛋白（envelope protein,E）、膜蛋白（membrane protein,M）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）、3'UTR和ploy-a尾（图1）。

图1 PEDV基因组排列顺序

pp1ab由PEDV基因组部分重叠的5'末端编码，可切割成16个非结构蛋白（nsp），命名为nsp1-16[3]。在这些蛋白中，每种结构蛋白和非结构蛋白在病毒复制、转录、翻译以及病毒与宿主细胞相互作用中都起着重要作用。各个结构蛋白以及基因组相互作用构成PEDV颗粒（图2）。

图2 PEDV病毒粒子结构

1.1.1 S蛋白

PEDV S蛋白是一种位于病毒表面的膜糖蛋白，具有高度的遗传多样性，在体内介导病毒进入、诱导中和抗体和病毒毒力方面起着关键作用[8]。基于完整PEDV S蛋白的系统发育分析可将PEDV分为G1型和G2型。G1组（如CV777和DR13）包括2个亚组（G1a和G1b），而G2组包括3个亚组（G2a、G2b和G2c)[9]。与G1 PEDV相比，G2 PEDV的S基因存在典型的插入和缺失突变，这可能会显著影响PEDV菌株的免疫原性[10]。这可能是目前市面上以CV777减毒毒株为基础的商品化疫苗不能有效预防G2 PEDV流行毒株的原因[11]。冠状病毒利用同型三聚体刺突糖蛋白与细胞受体结合[12]。PEDV穗状单体包括1个几乎完全由β-片组成的S1亚基和1个由一系列不连续α-螺旋组成的S2亚基[13]。冠状病毒S1亚基与细胞受体结合，随后由S2亚基中HR1区和HR2区组成的六螺旋束（6-HB）介导病毒与细胞膜融合[14]。鉴定冠状病毒受体对于药物和疫苗的开发至关重要[15]。S蛋白含有多个B细胞表位，如722SSTFNSTREL731、748YSNIGVCK755、764SQYGQVKI771、1368GPRLQ-Y1374等[16-18]。S1区的核心中和表位区（COE）已被广泛应用于PEDV亚单位疫苗开发。因此，S蛋白是研制冠状病毒减毒活疫苗和亚单位疫苗的主要靶点。

1.1.2 M蛋白

M蛋白是一种定位于整个细胞质的膜糖蛋白，通过细胞周期蛋白a途径诱导细胞周期阻滞在S期[19]。PEDV M基因在冠状病毒之间存在显著差异，但在不同PEDV毒株之间差异较小[20-21]。因此，M蛋白是建立ELISA、RT-q PCR、RT-PCR等多种检测方法的理想靶点[22-23]。通过杂交瘤技术筛选的M蛋白上的B细胞表位195WAFYVR200在PEDV病毒中具有高度保守性和特异性。M蛋白高度保守并含有线性B细胞表位，能够诱导机体产生IFN-α，从而刺激机体产生免疫保护，可以考虑将其作为开发抗原表位疫苗的靶点。

1.1.3 E蛋白

PEDV中最小的结构蛋白是E蛋白，分子量仅为7 k D左右，不同冠状病毒间同源性较低[24]。E蛋白在病毒组装和出芽过程中起着至关重要的作用[25]。此外，PEDV E蛋白可在体外诱导内质网应激，激活核因子-κB(NF-κB）通路[26]。PEDV E蛋白跨膜结构域16-20aa的缺失和L25P突变也会进一步上调内质网应激指标的产生，提高IL-6和IL-8的表达，进而促进体外细胞凋亡[27]。此外，PEDV E蛋白被证实可以抑制Ⅲ型IFN的表达，但具体的分子机制尚不清楚[28]。有研究表明，缺乏E蛋白的SARS-Co V在小鼠中的毒力显著降低[29]。然而，PEDV E蛋白是否影响病毒毒力，以及E蛋白是否为PEDV所必需，还有待进一步研究。此外，E蛋白可作为一种诊断工具，有助于开发新的血清学检测方法及设计疫苗[30]。

1.1.4 N蛋白

PEDV N蛋白是一种高度保守的磷酸化蛋白，在不同菌株中仅有少量点突变。在病毒生命周期中，N蛋白与多种功能有关，包括调控病毒RNA合成，将病毒RNA包装于螺旋状核衣壳中，以及完成病毒粒子的组装[31-32]。在与宿主细胞对抗的过程中，PEDV N蛋白不仅通过延长细胞S期来抑制细胞增殖[33]，还通过阻止IPEC-J2细胞中NF-κB的核易位来拮抗IFN-λ的产生[34]。在过表达N蛋白的Vero E6细胞中，PEDV的复制增强可能与N蛋白抑制宿主反应有关[35]。N蛋白的抗原性很强，在机体感染早期就能够刺激产生高水平的N蛋白抗体，因而N蛋白是早期检测PEDV感染的重要指标[36]。

1.2生物信息学数据库及主要分析工具

生物信息学数据库为NCBI。

主要分析工具包括MEGA 11.0、i TOL、Gene Doc 2.7(nrbs c.org/gfx/genedoc）、DNASTAR 7.1和Vaxi Jen 2.0。

1.3 PEDV毒株核苷酸序列获取

在Gen Bank中选取50个已发表的国内外流行毒株和经典毒株的S1基因作为参考序列（表1），其中包括疫苗毒株、各基因型代表毒株和参考毒株。同时，从NCBI数据库收集了fasta文件格式的PEDV CH/HNLYL/2021疫苗株（ON960076.1）基因组序列作为后期疫苗研发参考。

表1 PEDV S1基因序列参考毒株信息

1.4分析方法

1.4.1遗传演化分析

使用MEGA 11.0软件将50个PEDV毒株S1基因进行序列比对并构建系统发育树。NJ（邻域连接）树基于50个全局毒株构建，使用1 000个引导复制。

1.4.2同源性分析

使用DNASTAR 7.1软件对50个PEDV毒株S1基因序列进行同源性分析。

1.4.3氨基酸位点分析

使用Gene Doc 2.7软件选取14个PEDV毒株S1基因序列进行氨基酸位点突变分析，包括1个疫苗株（CH/HNLYL/2021）、11个不同基因型代表毒株和同疫苗株亲缘性最高的2个毒株（CH-He N22-2022和CH-He N25-2023）。

1.4.4蛋白抗原性预测

使用Vaxi Jen 2.0工具预测PEDV各蛋白抗原性，其基于无对准方法计算属性，主要从理化性质方面进行计算。

1.4.5蛋白理化性质和结构评价

使用Expasy(expert protein analysis system，专家蛋白分析系统）的Prot Param工具来评估各蛋白的物理和化学性质。Prot Param能从蛋白质序列计算物理化学性质，但它不能指定蛋白质的翻译后修饰，也不能指定成熟蛋白质将形成单体或多二聚体。通过SOPMA进行二级结构分析，使用Alpha Fold2 0.4.31进行靶蛋白的三级结构建模。Alpha Fold2是目前最精准广泛使用的结构预测工具之一，它使用基于同源的方法预测查询蛋白的3D结构。

2、结果与分析

2.1遗传演化分析

S1基因遗传演化分析结果如图3所示。所构建的遗传进化树主要分为3个大分支，即S-INDEL、G1和G2基因群。系统发育分析表明，S-INDEL毒株可能是G1a CV777谱系经典毒株和G2毒株的重组毒株。G1基因群（经典株）包括G1a亚群和G1b亚群，G2基因群（变异株）包括G2a亚群、G2b亚群和G2c亚群。G1的2个亚群（G1a和G1b）由CV777、Virulent DR13和早期的中国菌株JS2008组成。G2的3个亚群（G2a、G2b和G2c）由AJ1102、XJ-DB2、LW/L等变异株组成。值得注意的是，2010—2023年发现的菌株大部分都在G2基因群中。此外，S1基因的系统发育树显示，CH/HNLYL/2021疫苗株属于G2c，与中国菌株CH-He N22-2022、CH-He N25-2023较接近，并且与2015—2023年的13株流行株属于同一个小分支。该分支包含了国内最近几年的许多主要流行毒株，说明该毒株为目前流行毒株。

图3 S1基因进化树

2.2同源性分析

S1基因同源性分析结果如图4所示。分析可知，G2c基因亚群毒株与CV777、Virulent DR13、KPEDV-9、83P-5、SD-M、P5-V等G1a疫苗株的亲缘关系很远，它们之间的核苷酸同源性为90.7%～91.8%；与XJ-DB2、GD-B疫苗株等G2a疫苗株亲缘关系较近，与变异减毒株PC21A等参考毒株位于不同分支，它们之间的核苷酸同源性为97.4%～98.3%；与LW/L、AJ1102等G2b疫苗株，以及广东流行毒株FL2013的亲缘关系较近，它们之间的核苷酸同源性为96.6%～97.7%。结果表明，现有变异疫苗株对经典毒株的预防效果较好，但是对于现阶段的流行毒株预防效果有限。此外，疫苗株与同一分支的四川流行毒株CH/SCXC/2018、CH/SCAZ10/2017等国内变异流行毒株亲缘关系较近，它们之间的核苷酸同源性为97.5%～99.9%；与3株国内流行株PEDV/CH/HN/NK1/2021、CH-He N22-2022和CH-He N25-2023的核苷酸同源性较高，分别为99.7%、99.9%和99.9%，说明其存在共同祖先，具有密切关系。

图4 S1基因同源性分析

2.3氨基酸突变位点分析

经氨基酸突变分析发现，在所选毒株中，G2基因群和G1基因群在第28～30、67～72、86～87、89、121、130～131、139、180、186、202～204、211、228、238、247～248、315、348、369、600、725、729位发生了较一致的突变，分别为QST→SAN、GTGIE→AGQHP、Y→H、DS→RG、Q→H、I→T、DN→SI、V→A、A→S、I→F、KRS→SGG、T→E、Y→S、S→I、DS→EP、A→V、L→F、T→I、G→S和N→S。CH/HNLYL/2021、CH-He N22-2022和CH-He N25-2023在第151、542位发生了与其他基因群均不一致的突变，均为F→L；在第232位发生了较不一致的突变，为P→L；其余突变位点多与G2基因群一致。这表明该位点可能是G2c亚群毒株常见突变位点。

2.4蛋白抗原性预测

Vaxi Jen 2.0分析得到PEDV各蛋白抗原性预测结果（表2）。可以看出，作为结构蛋白的M、N蛋白抗原指数较高，分别为0.631 4和0.613 5，表明M、N蛋白具有作为亚单位疫苗设计靶点的潜力。

表2 PEDV各蛋白抗原性预测

2.5抗原蛋白理化性质和结构评价

Prot Param分析得到预测结果如表3所示。S蛋白分子量为151.77 ku，理论等电点为5.18，不稳定指数（Ⅱ）计算结果为30.99，脂溶指数为91.59，亲水指数的平均值为0.111，故将其归类为稳定的疏水性蛋白质。M蛋白分子量为25.37 ku，理论等电点为9.33，不稳定指数（Ⅱ）计算结果为38.41，脂溶指数为112.48，亲水指数的平均值为0.540，因而将其归类为稳定的疏水性蛋白质。N蛋白分子量为48.96 ku，理论等电点为9.90，不稳定指数（Ⅱ）计算结果为40.48，脂溶指数为59.05，亲水指数的平均值为-1.078，因而将其归类为不稳定的亲水性蛋白质。

SOPMA服务器对二级结构的预测结果（表4）表明：S蛋白α螺旋为27.74%,β转角为4.18%，随机线圈为40.78%，延伸链为27.31%;M蛋白α螺旋为38.94%,β转角为7.08%，随机线圈为36.28%，延伸链为17.70%;N蛋白α螺旋为18.82%,β转角为7.71%，随机线圈为55.78%，延伸链为17.69%。

表3 PEDV抗原蛋白的理化特性

表4 PEDV抗原蛋白二级结构

通过Alpha Fold2 0.4.31服务器预测了MEV三级结构的最佳模型（图5），并使用UCSF Chimera X软件按照B因子值分布对其进行可视化。该结果对于未来PEDV蛋白结构的进一步研究有一定意义。

3、结论与讨论

2020年以来，PEDV G2c毒株成为我国各地区主要流行毒株，这与其高致病性特性密不可分。此外，S-INDEL毒株可能是G1a CV777谱系经典毒株和G2毒株的重组毒株，表明各毒株之间的重组可能会是PEDV遗传变异的另一个方向。在各基因群中，氨基酸突变位点相对稳定，表明该基因可作为基因分型依据，可以为后续研发相应基因型的疫苗提供理论参考。

图5 PEDV S、M、N蛋白三级结构预测及序列覆盖分析

基金资助:四川省科技成果转移转化项目“高致病性禽流感DNA疫苗技术成果转化”(2022ZHCG0024);

文章来源:孙在兴,邱文英,扶海,等.猪流行性腹泻病毒S1基因遗传进化分析及蛋白结构预测[J].现代农业科技,2024,(21):146-152+164.