细菌性肠炎是一类常见的动物肠道疾病，由大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌感染引发的急性肠道炎症，其发病率在全球范围内逐渐增长，导致机体出现呕吐、腹泻等症状，并造成肠道菌群紊乱，严重时会导致动物大面积死亡，严重危害畜牧业的发展[1]。目前，临床上主要使用抗菌药来控制此类疾病，但抗菌药的不规范使用，使细菌的耐药问题愈发严重，并且会导致严重腹泻的复发，加重肠道生态失调[2-3]。因此，寻找一种应用于细菌性肠炎的防治药物成为当前研究热点话题之一。

中药相比于抗生素具有低残留、不易产生耐药性等优点，越来越多的研究表明中药单体可被应用于动物肠道疾病的防治。槲皮素是一种黄酮类化合物，来源于植物，如苹果、浆果、豆类等，具有抗菌[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等多种药理活性。槲皮素具有抗菌的潜力，并且不易引起细菌产生耐药性。现代药理学研究表明，槲皮素可以通过调节炎症因子分泌，抑制炎症通路的激活，调节肠道菌群，抑制炎症反应等发挥作用[7-8]。槲皮素能有效改善由LPS引起的肠道炎症，减少细胞焦亡，保护组织免受损伤[9]。

网络药理学是一门以系统生物学、药理学和生物信息学为背景，研究疾病机制和药物作用机制的新兴学科，为药物的发现、开发和研究提供了新的工具。网络药理学作为新兴的研究药理学的重要手段之一，通过整理网络数据库的资源，学者可以快速、准确地分析药物成分、结构、作用方式及临床疾病等信息。近年来，采用网络药理学预测溃疡性结肠炎[10]、肺纤维化[11]、乳房炎[12]的文献屡见不鲜。因此，研究旨在通过网络药理学，揭示槲皮素治疗细菌性肠炎的关键靶点和作用通路，并利用分子对接技术对预测结果进行佐证，为后续槲皮素治疗细菌性肠炎的体内外研究提供理论基础。

1、材料与方法

1.1 槲皮素靶点的获取

通过使用中医药系统药理学数据库平台（TCM-SP）中的“Chemical name”的选项，输入槲皮素的英文名称“Quercetin”，进行靶点检索。通过Pub Chem数据库检索槲皮素分子结构式，保存为SDF格式文件，将获得的分子结构式上传至SwissTarget数据库进行药物靶点的预测，二者汇总后，删除重复项，与UniProt数据库规范化处理，最终确定槲皮素的主要靶点。

1.2 细菌性肠炎相关靶基因的筛选

在人类基因数据库GeneCards数据库，以“Bacterial enteritis”作为检索项，获得细菌性肠炎相关基因。在GeneCards数据库中，评分越高代表该靶点与疾病关联越紧密。当靶点数目较多时，可将Relevance score≥中位数的相关靶点作为细菌性肠炎潜在靶点。通过GeneCards获取Relevance score最大值78.33，最小值0.186，中位数0.982，选取Score≥0.982为细菌性肠炎重要靶点，导入UniProt数据库进行标准化处理。

1.3 共有靶点的确定

将槲皮素相关靶点和细菌性肠炎靶点导入Venny 2.8.0平台进行映射取交集，构建韦恩图，以获取槲皮素治疗细菌性肠炎的潜在作用靶点。

1.4 蛋白质（PPI）网络构建

将槲皮素-细菌性肠炎共有靶点导入STRING数据库，构建药物-疾病共有靶点的蛋白相互作用网络。为确保数据的可靠性，最低相互作用阈值设为0.7，去除游离节点，以TSV格式文件输出。随后，导入Cytoscape 3.7.2软件中，对构建预测中药单体抗细菌性肠炎PPI网络进行可视化分析。采用CytoNCA插件计算各节点拓扑参数，度值（Degree）、介数（Betweenness）、节点紧密度（Closeness）均大于平均数的节点为关键靶点。

1.5 GO功能富集分析

将槲皮素-小鼠细菌性肠炎共有靶点导入Metascape数据库，对其进行定制分析，进行基因本体论（Gene Ontology,GO）功能富集分析。选择GO功能富集分析中生物过程（Biological Process,BP）、细胞组分（Cellular Component,CC）和分子功能（Molecular Function,MF）并进行可视化处理，选择基因最多的10个条目，以条目名称为纵坐标，以条目中基因个数为横坐标，富集结果的P值以颜色表示，绘制GO功能柱状图。P<0.01认为富集的条目有统计学意义。

1.6 KEGG通路富集分析

将槲皮素-细菌性肠炎共同靶点导入Metascape数据库，对其进行KEGG通路富集分析。选取P值最小的20个条目，以涉及靶点的个数与共有靶点的比值为横坐标，以条目名称为纵坐标，富集结果的P值以颜色表示，基因数用气泡大小表示，作KEGG通路气泡图。P<0.01认为富集的条目有统计学意义。

1.7 分子对接

在PDB数据库并结合相关文献查询靶蛋白（受体），输出PDB格式文件，利用Pymol 2.5.0软件删除所有水分子和多余配体，利用AutoDock 1.5.6再加氢、计算电荷并合并非极性氢后，将其保存“pbdqt”文件。在Pub Chem网站中下载槲皮素小分子化合物（配体）的3D结构，利用Open babel工具包转化其Mol2格式文件，利用AutoDock 1.5.6设置可旋转键后，将其保存“pbdqt”文件。将配体与受体者导入AutoDock 1.5.6软件进行分子对接，采用Local Search4.2算法进行分子对接计算，并计算结合能，对接结果通过Pymol 2.5.0软件进行可视化。

2、结果

2.1 槲皮素靶点的搜集

共获取槲皮素相关靶点212个，细菌性肠炎相关靶点4 103个，将其上传至Venny 2.8.0平台取交集，得到156个共有基因（图1），即槲皮素治疗细菌性肠炎的潜在作用靶点有156个。

2.2“槲皮素-疾病”PPI网络构建及核心靶点筛选

利用STRING在线数据库分析槲皮素抗细菌性肠炎靶点之间的交互作用，PPI网络包含149个节点，1 078条相互作用线，平均节点度13.8，局部聚类系数0.494，显示了多靶点治疗的特点。将结果导入Cytoscape 3.7.2软件进行分析，利用CytoNCA插件计算各节点拓扑参数，网络度值为14、节点介度为0.010 086 857、节点紧密度为0.416 172 472，经筛选获得32个关键靶基因，绘制PPI网络图（图2）。图中具有32个靶点，82条边，包括TP53(Tumor Protein p53,p53肿瘤蛋白基因）、AKT1(Serine/Threonine Kinase 1，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1）、JUN(Transcription factor AP-1，转录因子JUN）、HSP90AA1(Heat Shock Protein 90 Alpha Family Class A Member 1，热休克蛋白90α家族A类成员1）、SRC(Tyrosine-protein kinase SRC，原癌基因SRC）、TNF(Tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子）、IL-6(Interleukin-6，白介素-6）、EGFR(Epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体）、MAPK1(Mitogen-activated protein kinase 1，丝裂原活化蛋白激酶1）、VEGFA(Vascular endothelial growth factor A，血管内皮生长因子A）等（表1）。

图1 槲皮素靶点与疾病靶点的维恩图

图2 槲皮素-细菌性肠炎交集靶点的PPI网络图

表1 32个关键靶基因及其拓扑参数

2.3 GO富集分析

对156个槲皮素-细菌性肠炎相互作用靶点上传至Metascape数据库进行GO功能富集分析，得到2 157条差异显著条目（P<0.01），其中生物过程（BP)1 855条，细胞组分（CC)112条，分子功能（MF)190条。由于条目过多，采用柱状图形式可视化，BP主要涉及细胞对氮化合物的反应、细胞对有机氮化合物的反应、对激素反应肽的反应等。CC主要涉及膜筏、膜微域、细胞质核周区等。MF主要涉及磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性等（图3～图5）。以上的BP、CC和MF是每个细胞和机体生存最基本的结构和功能，因此，GO分析结果与细菌性肠炎的发生发展过程密切相关。

图3 GO BP富集分析

图4 GO CC富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

将156个靶点上传至Metascape数据库进行KEGG通路富集分析，得到201条差异显著条目（P<0.01）。由于条目过多，采用气泡图形式可视化，靶点主要涉及PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等，涉及炎症反应、细胞凋亡、免疫应答等多种作用途径（图6）。从而提示槲皮素通过抗炎、抑制细胞凋亡以及调节免疫应答等多种途径对细菌性肠炎进行治疗。

图5 GO MF富集分析

图6 KEGG通路富集分析

2.5 分子对接

根据KEGG信号通路分析结果，槲皮素抗细菌性肠炎的作用机制可能与PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF等信号通路有关，共同作用靶点有AKT1、IL6、MAPK1、RELA。将这4个靶点分别与槲皮素进行分子对接，所有组合的结合能<0 kcal·mol-1，表示均能自发可结合（表2），证实了网络药理学的结果的可靠性。其中MAPK1与槲皮结合活性良好，绘制分子对接细节（图7）。

表2 槲皮素与主要关键靶点的结合能

图7 MAPK1与槲皮素分子对接3D图

3、讨论

细菌性肠炎是一种常见的动物肠道类疾病，是由于细菌引起的肠道炎症，大肠杆菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌是这种疾病的常见病原体，其中大多数是革兰氏阴性杆菌。当革兰氏阴性杆菌进入体内时，其内毒素激活炎症信号转导途径，使机体产生和释放TNF-α、IL-6等炎症因子[16]。槲皮素是一种黄酮类化合物，广泛存在于水果和蔬菜中，具有抗炎、抗菌、抗癌等多种生物活性[17]。秦晓蓉等[18]采用药敏片法发现槲皮素对许多细菌有着明显的体外抗菌效果，且革兰氏阴性菌的抗菌作用强于革兰氏阳性菌。洪志伟等[19]研究表明，槲皮素对致病菌具有较好的抑制作用，并且指出槲皮素也具有杀菌作用。大量研究结果表明，槲皮素能够有效改善机体炎症，降低炎症因子的表达量。据李井贺[20]报道，槲皮素降低了产肠毒素大肠杆菌对IPEC-J2细胞的黏附能力，减轻了产肠毒素大肠杆菌诱导细胞产生的炎性损伤，发挥其抗感染和消炎的作用，保护肠道细胞免受细菌感染的作用。此外，徐云政[21]研究发现日粮中添加槲皮素缓解了早期断奶仔猪氧化应激、腹泻和肠道损伤，同时改善了早期断奶仔猪的肠道微生物多样性和功能。因此，文章通过网络药理学的方法探究槲皮素治疗细菌性肠炎的作用机制，为后续研究奠定理论基础。

通过构建槲皮素-细菌性肠炎的PPI网络，分析发现TP53、AKT1、JUN、IL-6等可能为槲皮素治疗细菌性肠炎的关键靶点。TP53是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子，并具有抗炎活性[22]。TP53表达的下调可能是炎症组织和细胞转化过程中最重要的因素。事实上，炎症细胞、细胞因子、趋化因子和生长因子产生活性氧和氮物质，导致DNA不可修复的氧化损伤，下调TP53的表达及功能[23]。因此，TP53表达的上调可加强抗炎活性，在改善炎症及肿瘤相关炎症中发挥重要作用[24]。此外，有研究结果表明，IL-6在溃疡性肠炎患者中表达水平升高，从而调控TP53表达水平下调，通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡在肿瘤发生中发挥作用。AKT1是由磷酸肌醇3-激酶（PI3K）激活的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在多项研究中被报道为炎症相关的关键信号节点，在细胞生长、增殖和凋亡等过程的调节中起关键作用[25]。

炎症细胞因子可通过与相应受体结合参与炎症反应的发生、特异性免疫应答的调控以及损伤组织的修复过程[26]。TNF-α是炎症细胞因子网络的关键部分，它可诱导IL-1、IL-6及IL-1β的释放，且能刺激免疫细胞释放NO、氧自由基等炎症介质，在炎症性病理性损伤中起到重要作用[27]。当机体发生腹泻时，TNF、IL-6、IL-1β表达水平均显著升高，可引起各种免疫细胞在炎症局部聚集，并释放炎症介质，加速炎症反应，加重肠黏膜损伤[28]。

通过GO功能和KEGG通路富集结果显示，在槲皮素抗细菌性肠炎的相关通路中，PI3K-AKT、AGE-RAGE、TNF信号通路有较高的富集性。PI3K/AKT通路在胃肠疾病的发生、发展及治疗中有着重要作用[29]。张玉洁[30]研究发现肠易激综合征模型组小鼠AKT、NF-κB、IKKα、IKKβ磷酸化增加，激活AKT/NF-κB信号通路，诱导炎症因子TNF、IL-6及IL-1β释放，减少肠屏障紧密连接蛋白的表达，从而促进了疾病的发生发展。因此，进一步筛查PI3K-AKT、AGE-RAGE、TNF信号通路与关键靶点的交集靶点，结果显示，AKT1、IL6、MAPK1、RELA在槲皮素抗细菌性肠炎中起到关键作用。

结合能代表配体与受体的结合程度，结合能越低代表配体与受体结合越稳定。分子对接结果表明，槲皮素与AKT1、IL6、MAPK1、RELA均能自发结合，其中与MAPK1结合具有较好的结合活性。对接细节分析发现，其活性位点是蛋氨酸108、天冬氨酸111、天冬氨酸167、赖氨酸54、谷氨酸73，说明MAPK1确为槲皮素治疗细菌性肠炎的一个核心靶点。

4、结论

研究基于网络药理学表明槲皮素通过调控不同的靶蛋白作用于不同的信号通路，对细菌性肠炎进行治疗，主要通路为PI3K-AKT信号通路。

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基金资助:研究生创新科研项目(YJSCX2022-Y27);

文章来源:张年洁,孟令滢,甄明哲,等.基于网络药理学分析槲皮素治疗细菌性肠炎的潜在机制[J].黑龙江八一农垦大学学报,2024,36(06):43-51.