恩诺沙星又名乙基环丙沙星,是动物专用的氟喹诺酮类广谱抗菌药物,对革兰阴性菌如大肠杆菌､ 巴氏杆菌､ 胸膜肺炎放线杆菌等,革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌及支原体等均表现较高的抗菌活性｡ 恩诺沙星通过抑制细菌DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ干扰细菌DNA复制过程而发挥抗菌作用[1]｡ 恩诺沙星进入动物体内后分布广泛,除了中枢神经系统外几乎所有组织的的药物浓度均高于血浆,在骨､ 滑液､ 皮肤肌肉等均可达到治疗浓度,因此血浆浓度可作为预测恩诺沙星在组织中疗效的替代标志物｡ 恩诺沙星口服或注射给药后, 10% ~ 40%在体内会转化为环丙沙星[2]｡ 环丙沙星的抗菌活性与恩诺沙星一样或更高,且与恩诺沙星有相加作用,药动学研究中常同时监测恩诺沙星和环丙沙星的体内行为[3-6]｡国内外已批准恩诺沙星片和恩诺沙星注射液用于宠物临床,其中用于犬的适应症为治疗消化道､ 呼吸道､ 泌尿生殖道､ 皮肤､ 伤口感染及中耳炎等[7]｡恩诺沙星片的推荐给药方案为口服, 5 mg·kg-1,每日1次,连用5 ~ 10 d[8]｡ 恩诺沙星注射液的推荐给药方案为肌内或皮下注射, 2. 5~5 mg·kg-1, 1~2次/ d,直至临床症状消失,最长用药期30 d[9]｡ 可见无论是片剂口服给药还是常规注射液注射给药一个疗程均须多次重复给药,耗费人力物力,还易致动物应激,且临床实践中往往因疏忽或其他不便而难以完全按照规定方案给药,影响药效发挥和疾病转归｡ 因此研发给药频次低､ 持效时间长的缓释恩诺沙星制剂有重要的实际意义｡ 本研究考察了自研的长效恩诺沙星油混悬注射液在犬体内的药动学行为,评价其缓释长效作用｡

1、材料与方法

1. 1主要药物､ 试剂与仪器

恩诺沙星对照品,含量99. 7%,批号H0081907,购于中国兽医药品监察所;盐酸环丙沙星对照品,含量99. 8%,批号H010310,购于中国兽医药品监察所;恩诺沙星油混悬注射液,规格为10%,实验室自制;乙腈,色谱级,购于北京百灵威科技有限公司;磷酸､ 二氯甲烷,分析纯,购于广东光华科技股份有限公司;三乙胺,分析纯,购于上海麦克林生化科技股份有限公司; Waters e2695型高效液相色谱仪,美国Waters公司｡

1. 2实验动物

成年健康比格犬6只,雌雄各半,体重(10. 85±1. 65) kg,购自江苏亚东实验动物研究中心,生产许可号: SCXK (苏) 2016 - 0009｡ 动物饲养于南京农业大学实验动物中心,饲喂不含任何药物的实验犬维持饲料,自由饮水,在试验前至少14 d内不给予任何药物｡ 所有动物试验均按照南京农业大学动物伦理委员会的指导方针进行,动物福利与伦理批准号为NJAU. No20220922175｡

1. 3主要溶液的制备

恩诺沙星储备液:精确称量恩诺沙星对照品0. 012 5 g置于25 mL量瓶中,加入适量流动相,超声使溶解并用流动相稀释至刻度,摇匀,制成0. 5mg·mL-1的储备液,于-20℃ 条件下储存｡ 盐酸环丙沙 星 储 备 液:精 确 称 量 盐 酸 环 丙 沙 星 对 照 品0. 014 1 g置于25 mL量瓶,加入适量流动相,超声使溶解并稀释至刻度,摇匀,制成环丙沙星浓度为0. 5 mg·mL-1的储备液,于-20℃条件下储存｡系列工作液:将恩诺沙星储备液和盐酸环丙沙星储备液等比例混匀,用流动相精密稀释成浓度均为1. 25､5､12. 5､25､50､100､150μg·mL-1的系列标曲混合工作液和浓度 均 为1. 25､2. 5､75､125μg·mL-1的系列质控混合工作液,于2 ~ 8℃ 条件下保存｡

1. 4血浆样品检测

色谱条件固定相为十八烷基硅烷键合硅胶柱(4. 6 mm ×250 mm, 5 μm),流动相为0. 1 mol·L-1磷酸溶液 ∶乙腈(84∶16),流速为0. 8 mL·min-1,检测波长为278 nm,进样量为20 μL,柱温为35℃ ｡

1. 5血浆样品预处理

取血浆样品500 μL,加入50 μL磷酸,涡旋1 min,加入1 mL乙腈,涡旋3 min, 12 000 r·min-1离心10 min,上 清 液 移 至5 mL离 心 管 内,加 入1. 5 mL二氯甲烷,涡旋3 min, 4 000 r·min-1离心10 min,将上清液移至1. 5 mL离心管中, 12 000r·min-1离心10 min后精确吸取20 μL注入液相色谱仪｡

1. 6血浆样品检测方法学验证

1. 6. 1专属性

取6只不同犬的空白血浆样品､ 空白血浆加恩诺沙星和环丙沙星对照品溶液､ 恩诺沙星油混悬注射液给药后的犬血浆样品,按照1. 5方法处理后进样检测｡

1. 6. 2标准曲线和线性范围

取空白血浆480 μL,加入系列标曲混合工作液20 μL,制成浓度为0. 05､0. 2､0. 5､1､2､4､6μg·mL-1的系列标曲混合血浆样品,按照1. 5方法处理后进样检测｡ 以恩诺沙星浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制恩诺沙星标准曲线｡ 以环丙沙星浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制环丙沙星标准曲线｡

1. 6. 3准确度和精密度

取空白血浆480 μL,加入系列质控混合工作液20 μL,制成浓度为0. 05､0. 1､3､5 μg·mL-1的系列质控混合血浆样品｡ 每个浓度5个平行,连续制备并测定3个分析批,根据当日的标准曲线方程求得质控样品浓度,计算准确度､ 批内( n = 5)及批间(n = 15)精密度｡

1. 6. 4稳定性

对低､ 高浓度的质控样品进行下述条件的稳定性考察:预处理后样品自动进样室放置24 h稳定性,血浆样品-20℃冻融1次稳定性,血浆样品-20℃ 长期放置40 d稳定性,每个浓度3个平行｡

1. 7药动学试验设计

6只成年健康比格犬以20 mg·kg-1的剂量颈部皮下注射自制恩诺沙星油混悬注射液｡ 试验当天于给药前采集空白血液(0 h),给药后于0. 25､0. 5､1､2､3､4､6､8､10､12､14､24､30､36､48､54､60､72､78､84､96､102和108 h各时间点于犬的前肢头静脉采血3 mL, 3 954 r·min-1离心10 min分离血浆,于-20℃冻存,待测｡

1. 8数据统计与分析

将测得的恩诺沙星和环丙沙星峰面积代入当天制得的标准曲线中,分别进行计算得到各自的血药浓度｡ 使用Winnonlin软件8. 1. 0版本以非房室模型分析自制恩诺沙星油混悬注射液经犬皮下给药后恩诺沙星､ 环丙沙星､ 恩诺沙星+环丙沙星的血药浓度数据,获得药动学参数｡恩诺沙星为浓度时间双依赖型药物,基于环丙沙星与恩诺沙星的抗菌活性有相加作用,本文依据恩诺沙星､ 恩诺沙星+环丙沙星的血药浓度,从浓度依赖方面计算恩诺沙星单独的药峰浓度(Cmax ),药时曲线下面积(AUC0-24 h､AUC0-t),恩诺沙星+环丙沙星总的Cmax-Total､AUC0-24 h-Total､AUC0-t-Total,与敏感菌最低抑菌浓度(MIC)的比值;从时间依赖方面,分析在MIC之上的血药浓度持续时间即t>MIC,以评价自研的恩诺沙星油混选注射液的长效缓释作用[6,10-11]｡

2、结果与分析

2. 1方法学验证

2. 1. 1专属性

专属性试验色谱见图1｡ 结果显示,环丙沙星的保留时间约为7. 1 min,恩诺沙星的保留时间约为10. 0 min,二者之间互不干扰,保留时间处均没有干扰峰,与相邻杂质峰完全分离,专属性良好｡A.空白血浆样品; B.空白血浆加1 μg·mL-1恩诺沙星标准溶液; C.空白血浆加1 μg·mL-1环丙沙星标准溶液; D.空白血浆加1μg·mL-1恩诺沙星和环丙沙星标准混合溶液; E.给药后1 h的药动血浆样品｡图1恩诺沙星专属性试验典型色谱

2. 1. 2标准曲线和定量下限

由表1可见,恩诺沙星和环丙沙星在0. 05 ~ 6μg·mL-1范围内与各自峰面积的线性关系良好, R2>0. 99,定量下限实测浓度与标示值的准确度偏差均在±20%范围内,其余浓度的准确度偏差均在±15%以内｡

表1恩诺沙星标准曲线回归方程及相关系数分析

2. 1. 3准确度和精密度恩诺沙星和环丙沙星的准确度和精密度试验结果见表2｡ 结果显示,恩诺沙星和环丙沙星的定量下限准确度在标示值的90. 98% ~ 114. 30%范围内,批内及批间RSD在1. 06% ~ 10. 08%范围内;低､ 中､ 高浓度的准确度在标示值的88. 01% ~ 105. 95%范围内,批内及批间RSD在0. 71% ~ 7. 3%范围内,表明该方法准确度高､ 精密度好｡

表2准确度与精密度试验结果分析

2. 1. 4稳定性血浆中药物稳定性考察结果见表3｡ 结果显示,血浆中恩诺沙星和环丙沙星浓度的准确度均在标示浓度的85% ~115%内,且RSD小于15%,表明恩诺沙星血浆样品在不同储存条件下稳定性良好｡

表3稳定性试验结果

2. 2血药浓度6只受试犬以20 mg·kg-1剂量皮下注射恩诺沙星油混悬注射液后,体内恩诺沙星､ 环丙沙星及恩诺沙星+环丙沙星的平均血药浓度数据见表4,药时曲线见图2｡ 直至给药后108 h,恩诺沙星平均血药浓度仍达0. 1 μg·mL-1｡

表4犬皮下注射恩诺沙星油混悬注射液后恩诺沙星和环丙沙星的血药浓度

2. 3药动学参数

6只受试犬以20 mg·kg-1剂量皮下注射恩诺沙星油混悬注射液后,对体内恩诺沙星､ 环丙沙星及恩诺沙星+环丙沙星的血药浓度数据进行药动学参数分析,其消除相斜率(λz)､ 消除相的半衰期( t1/ 2λz)､达峰时间(Tmax)､ 达峰浓度(Cmax)､ 药时曲线下面积(AUC)､ 表观分布容积( Vz/ F)､ 消除率( Cl /F)､ 平均滞留时间(MRT)结果见表5｡ 犬皮下注射恩沙星油混悬注射液后,体内恩诺沙星的Tmax和t1/ 2λz分别为(3. 17±0. 75) h和(29. 39±5. 54) h,显示恩诺沙星油混悬注射液给犬皮下注射后释药缓慢;同时Cmax为(1. 28±0. 19) μg·mL-1,低于常规制剂以相同剂量皮下注射给药后的Cmax,显示恩诺沙星油混悬注射液给犬皮下注射后释药平稳,未发生突释情况,安全性更高｡图2犬皮下注射恩诺沙星油混悬液后恩诺沙星和环丙沙星平均血药浓度-时间曲线

2. 4药动学与MIC分析

以选择肠杆菌科和葡萄球菌科的MIC90及MIC折点(敏感),即0. 06､0. 12､0. 5μg·mL-1三种代表性的MIC值,计算了恩诺沙星和环丙沙星的Cmax､AUC､Cmax-Total和AUCTotal与MIC的比值,并列举t >MIC值,从浓度依赖和时间依赖两方面进行恩诺沙星油混悬注射液的有效性评估,结果见表6｡ 结果可见,对0. 06和0. 12 μg·mL-1, Cmax/ MIC､Cmax-Total/MIC在10. 65 ~ 27. 55之 间,满 足 大 于8的 要 求;AUC / MIC､AUCTotal/ MIC在143. 20 ~ 670. 10之间,满足大于100的要求,在浓度依赖型方面显示有效; t>MIC分别为108和78 h,在时间依赖方面长效时间长达3~4 d,在时间依赖型方面显示长效｡

表5犬皮下注射恩诺沙星油混悬注射液后恩诺沙星和环丙沙星的药动学参数

表6药动学参数与MIC的对比

3、讨论

生物样品分析方法的准确可靠､ 高效便捷对药动学研究意义重大｡ 恩诺沙星血药浓度检测前处理方法多采用沉淀蛋白后氮气吹干的方法,但氮气吹干步骤耗时较长[12-13]｡ 李朋朋等[14]放弃了氮气吹干步骤,在乙腈沉淀蛋白后经二氯甲烷液液萃取,取水层进行分析,效率大大提高,但该方法未验证环丙沙星的适用性｡ 故本研究在该方法基础上优化了提取步骤并进行了方法学验证,结果显示,恩诺沙星和环丙沙星互不干扰且保留时间处无杂峰干扰,专属性良好;恩诺沙星和环丙沙星均在0. 05~6μg·mL-1浓度范围内与峰面积线性良好( R2> 0. 99),准确度和精密度高,适用于同时分析犬血浆中恩诺沙星和环丙沙星浓度｡恩诺沙星常规制剂以口服或注射给药后,在犬体内的半衰期均较短,内服的半衰期为3. 7 ~ 5. 8 h,静脉注射的半衰期为2. 4 h,肌肉注射的半衰期为4 ~5 h[15],如Intorre等[16]报道了比格犬静脉注射恩诺沙星后,其t1/ 2β为(2. 74±0. 25) h, Küng等[17]报道了健康比格犬静注和口服恩诺沙星后, t1/ 2β分别为3. 7 h和2. 4 h｡ 本研究中,比格犬以20 mg·kg-1的剂量单次皮下注射恩诺沙星油混悬注射液后,恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的t1/ 2λz分别为( 29. 39 ±5. 54) h和(21. 61±11. 79) h,且直至给药后108 h,恩诺沙星平均血药浓度仍达0. 1 μg·mL-1,半衰期显著高于文献报道,血药浓度持续时间显著延长,缓释效果明显｡

恩诺沙星属于浓度和时间双依赖型抗菌药物,在浓度依赖型方面常以Cmax/ MIC比为8 ~ 10或AUC /MIC>100为最佳杀菌效果指标,时间依赖型方面多以高于MIC以上的血药浓度维持时间t>MIC为持效指标[18-19]｡ 恩诺沙星对犬源多杀性巴氏杆菌､ 耶尔森菌､ 大肠杆菌等的MIC为0. 008 ~ 0. 06μg·mL-1,对葡萄球菌的MIC90为0. 06~0. 12 μg·mL-1,对沙门菌MIC90小于0. 125 μg·mL-1[20-22]｡CLSI公布的动物源细菌抗菌药物敏感性试验纸片法与稀释法执行标准信息附录第二版中,恩诺沙星对犬源肠杆菌科细菌和葡萄球菌的MIC折点均为 ≤0. 5 μg · mL-1(敏感), 1~ 2μg·mL-1(中介)和≥4 μg·mL-1(耐药)｡ 环丙沙星具有与恩诺沙星相同,甚至更强的抗菌活性,且二者有相加作用,故诸多研究采用恩诺沙星+环丙沙星的浓度Cmax-Total和AUCTotal进行有效性评价[3-6]｡Eshar等[23]和Cole等[24]在犬注射恩诺沙星的药动学研究中,选择0. 5μg·mL-1的MIC值,对比Cmax-Total/ MIC和AUCTotal/ MIC来评估有效性｡Rao等[25]选择0. 1μg·mL-1的MIC值,对比恩诺沙星与环丙沙星总浓度在MIC之上的持续时间即t>MIC来进行恩诺沙星给药方案的选择｡ 本研究选择0. 06､0. 12､0. 5 μg · mL-1三种代表性的MIC值, Cmax､AUC､Cmax-Total和AUCTotal与MIC的比值,同时考察t>MIC,从浓度依赖和时间依赖两方面进行评估,结果对于MIC值为0. 06 μg·mL-1和0. 12 μg·mL-1时,Cmax/ MIC､Cmax-Total/ MIC均 大 于10, AUC0-24 h/ MIC､AUC0-t/ MIC､AUC0-24 h-Total/ MIC､AUC0-t-Total/ MIC均大于143. 20,在浓度依赖型方面满足有效性标准;t>MIC分别为108和78 h,在时间依赖方面长效时间长达3~ 4 d;均显示恩诺沙星油混悬注射液可以有效､ 长效杀菌｡MIC值为0. 5 μg · mL-1时, Cmax/MIC､Cmax-Total/ MIC为2. 56和3. 30, AUC0-24 h/ MIC､AUC0-24 h-Total/ MIC为34. 37和45. 80, AUC0-t/ MIC和AUC0-t-Total/ MIC为63. 92和80. 42｡ 也有报道AUC /MIC值在30 ~ 50之间恩诺沙星即可有效治愈细菌感染[10-11]｡以上结果表明,恩诺沙星油混悬注射液以20mg·kg-1的剂量皮下注射对敏感菌有长效作用,因此可以研发相应的缓释制剂实现减少给药频次的目的｡

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文章来源:马瑞霞,郭凡溪,苗强强,等.恩诺沙星油混悬注射液在犬体内的药代动力学研究[J].畜牧与兽医,2025,57(02):71-77.