牦牛是青藏高原地区畜牧业发展所依赖的主要特色畜种，主要分布在3 000 m以上的高海拔地区[1]。它们不仅能有效利用高山草甸草场资源，还能提供肉、乳、毛等特色畜产品，因具有抗缺氧、耐高寒等品种优势而享有“高原之舟”之美誉[2]。然而，青藏高原自然生态条件限制了牦牛产业的发展，牦牛生产性能远低于肉牛，其高效发展受到严重制约。在当前的基因组信息学时代，越来越多的研究者尝试利用基因组寻找到某些关联用来选择动物最佳的生产性状，以在短时间内获得快速的遗传增益[3],因此利用现代生物技术手段进行分子育种已成为提高牦牛种质特性和生产性能的重要措施之一。生长激素(growth hormone, GH)是机体生长发育的重要调控因子，具有促进生长、调节物质代谢、影响生殖和免疫等生物学功能，主要体现在促进肌肉和骨骼等组织细胞的增殖和分化方面[4]。GH基因在组织和细胞中发挥作用，首先与靶细胞表面的生长激素受体(GHR)基因结合，由GHR基因介导将信号转入细胞内从而产生一系列的生理效应。GHR基因是催乳素、生长激素、细胞因子、促红细胞生成素受体超家族成员之一，其信号经由Jak-Stat路径介导。GHR基因还可以以二聚体的形式与GH基因结合，从而导致GHR二聚体的形成，进而激活Janus激酶2(janus kinase2,2JAK2)[5]。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)是胰岛素样生长因子家族中重要成员之一，可通过内分泌、自分泌和旁分泌3种途径产生低分子多肽，调节细胞增殖和胚胎发育[6],是调解机体生长、发育和代谢的一个重要因子[7]。海汀等[8]研究发现，IGF-1基因不仅具有类似胰岛素的生物学功能且能介导GH,而且在胚胎发育过程中可以抑制细胞凋亡。近年来，对于调控生长发育相关基因的研究多集中在猪、羊、马等动物上。P. D. Vize等[9]测定了不同日龄大白猪和梅山猪的血清GH基因水平，发现在45日龄后GH基因水平呈显著降低趋势。冉雪琴等[10]研究了香猪IGF-1基因mRNA特异性表达情况，结果显示肝脏组织表达量最高，证实IGF-1基因在猪的肝脏组织中能特异性地稳定表达。闫云峰等[11]分析了GH基因和IGF1基因在蒙古马不同组织中的表达量，发现这两种基因表达量存在显著差异，而且其表达模式在不同器官和多个组织中存在差异性，该研究结果为蒙古马的品种选育与改良工作提供了宝贵的生物学信息。

目前，对牦牛GH基因和IGF-1基因的相关研究大多集中在不同牦牛品种间基因多态性及其与生产性状的关联分析方面[12],而对其在牦牛不同生长阶段、不同器官/组织中表达的研究鲜见报道。因此，本研究测定了GH基因和IGF-1基因在牦牛不同生长阶段、不同器官/组织中的表达量，以期揭示其在牦牛生长过程中对生产性状影响的分子遗传学机制，为开展牦牛的分子育种提供可借鉴的分子遗传学参考和理论支持。

1、材料

1.1 试验动物

在四川省阿坝州红原县四川省草原科学研究院牦牛科技园区内，选取健康无病的0.5岁(6头)、1.5岁(10头)、2.5岁(8头)及3.5岁(8头)麦洼公牦牛共32头作为试验动物。

1.2 主要试剂

基因组DNA广谱型小量纯化试剂盒，购自宝信生物科技有限公司；反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit),购自北京艾德莱生物科技有限公司；2×SYBR®Green预混液，购自北京百奥莱博科技有限公司；细胞裂解液、蛋白酶K、无水乙醇，均购自上海哈灵生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

荧光定量PCR仪(型号为analytikjena-qTOWER2.2)、普通PCR仪(型号为analytikjena-Easycycler)、超微量核酸蛋白测定仪(型号为scandrop100),均购自德国耶拿公司；离心机(型号为SCILOGEX D3024R),购自美国赛洛捷克公司；凝胶成像系统(型号为G2s-2010) ,购自上海天能科技有限公司；移液器，购自美国Bio-Rad公司；qPCR全自动加样仪(型号为M1型),购自四川科劲生物科技有限公司。

2、方法

2.1 样品采集

参照《牦牛屠宰技术规程》(DB63/T 1785—2020)中的方法屠宰牦牛，分别采集肝脏、心脏、股肌、背最长肌和腰大肌等器官/组织样品，经DEPC水处理后迅速投入液氮中保存，备用。

2.2 引物设计与合成

参照参考文献[13],以GAPDH基因为内参基因，根据GenBank中牦牛GH mRNA序列和普通牛IGF-1 mRNA序列并应用Primer Premier 5.0软件设计qPCR引物，信息见表1。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1引物信息

2.3 总RNA提取与质控

按照基因组DNA广谱型小量纯化试剂盒说明书提取牦牛各器官/组织的RNA,并用琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪对提取的总RNA进行检测，-80 ℃保存，备用。

2.4 反转录与qPCR扩增

使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,以cDNA为模板进行qPCR,扩增体系(总体积为20 μL):cDNA模板 2 μL,10 μmol/L上下游引物各0.8 μL,2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL,ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL,ddH2O 6 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸10 s, 共40个循环，在每个循环结束时，按每5 s上升0.5 ℃的速率检测65～90 ℃区间的荧光信号并进行熔解曲线分析。

2.5 数据统计与分析

采用2-ΔΔCt法计算GH、IGF-1基因的相对表达量，用内参基因GAPDH对不同组织中的表达水平进行均一化处理，并使用SPSS 10.0软件中的单因素方差分析法分析牦牛不同年龄段、不同器官/组织间GH、IGF-1基因相对表达量的差异性，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

3、结果与分析

3.1 总RNA提取及PCR扩增结果

凝胶电泳检测结果表明，RNA质量较好，可明显看到28S、18S和5S rRNA条带(见图1),说明提取的总RNA无明显降解。

图1总RNA的提取结果

1. GH基因；2.IGF-1基因。

超微量核酸蛋白测定仪检测结果为OD260/OD280值为1.89～1.97,浓度为228～397 ng/μL,表明提取的总RNA纯度和浓度均能满足后续反转录和定量PCR试验的要求。使用牦牛cDNA为模板，对GH、IGF-1和GAPDH基因引物进行qPCR扩增，获得它们的熔解曲线，结果(见图2)显示，GH基因在熔解温度(Tm)为(76.0±0.5)℃、IGF-1基因在Tm为(80.0±0.5)℃、GAPDH基因在Tm为(83.0±0.5)℃时呈现单一峰，表明引物的特异性良好，可以用于定量分析。

3.2 GH基因相对表达量的检测

结果见图3。

由图3可知：GH基因在各龄段的不同器官/组织中呈现不同的表达水平。在0.5岁牦牛群体中，肝脏和股肌的相对表达量显著高于心脏、腰大肌和背最长肌(P<0.05);在1.5岁牦牛群体中，肝脏的相对表达量显著高于心脏、股肌、腰大肌和背最长肌(P<0.05);在2.5岁牦牛群体中，各器官/组织中的相对表达量均很低，且差异不显著(P>0.05);在3.5岁牦牛群体中，除了肝脏中有少量表达外，其余器官/组织的相对表达量极低且均差异不显著(P>0.05)。

图2GH、IGF-1和GAPDH基因的熔解曲线

图3GH基因相对表达量的测定结果

3.3 IGF-1基因相对表达量的检测

结果见图4。

图4IGF-1基因相对表达量的测定结果

由图4可知：在0.5～3.5岁的牦牛群体中，IGF-1基因在肝脏中的相对表达量均显著高于股肌、心脏、腰大肌及背最长肌(P<0.05);在0.5岁、1.5岁和3.5岁牦牛群体中，股肌、心脏、腰大肌及背最长肌中相对表达量较低且均差异不显著(P>0.05);在2.5岁牦牛群体中，IGF-1基因在股肌中的相对表达量显著高于心肌、腰大肌和背最长肌(P<0.05)。

4、讨论

动物生长轴(GH-IGFs轴)是近年来国内外研究的热点。GH-IGFs轴在动物生长中发挥着重要的作用，GH基因通过与GHR基因相互作用，激活一系列的信号通路，将胞外信号转导到细胞核中，活化促进蛋白质合成和细胞分裂的转录因子[14-15]。

GH基因大小约为1 800 bp, 包含5个外显子和4个内含子[16]。GH是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种肽链激素，由191个氨基酸组成，具有广泛的生理功能，能影响到几乎所有类型的组织和细胞的功能，对组织生长、脂肪代谢、超排卵反应、排卵率、受精率、胚胎质量等生殖性状也有重要影响[17-18];且GH基因在动物出生前就发挥了一定的作用，其能够干预细胞分裂和生长、软骨形成等[19]。闫云峰等[20]研究发现，萨福克羊GH基因和IGF-1基因能影响生长发育、免疫系统和繁殖性能，且GH基因和IGF-1基因均具有一因多效作用。S. M. El-Komy等[21]研究发现，埃及水牛GH基因在3月龄臀肌中的表达量高于1岁龄，且随着年龄增长表达量降低，说明GH基因主要表达于幼龄阶段，对机体器官、肌肉组织等发育有一定的积极作用，不仅可以产生GH促进机体生长发育，而且还可以加速蛋白质合成，增加胶原组织含量，促进软骨细胞分裂，加速软骨生长。在本研究中，GH基因在0.5岁和1.5岁的牦牛群体中呈现不同程度的高表达，在其余年龄段表达较少，说明GH基因对肌肉组织及机体的生长发育有着重要作用，与傅芳等[22]的研究结果一致；在0.5岁牦牛群体中，除了肝脏，GH基因在股肌中的相对表达量也较高，说明其与牦牛某些肌肉组织的生长发育密切相关；在1.5岁牦牛群体中，GH基因在肝脏和心脏中的相对表达量均较高，而肝脏和心脏属于循环系统，说明其对循环系统的发育具有重要的调控作用；在2.5岁和3.5岁牦牛群体中，GH基因的相对表达量较低，说明随着年龄的增长GH基因表达水平会呈现明显的下降趋势，其或许仅对生长期的幼龄动物有效。

IGF-1是一种重要的生长调节因子和细胞内信号转导的介质，对动物生长发挥着至关重要的作用；由多个肽链组成，包含70个氨基酸，这些氨基酸共同构成了复杂的分子结构基础[23]。IGF-1基因在人体内主要通过血液循环发挥生理功能，影响不同类型细胞的分化和增殖过程，包括骨骼肌细胞、心肌细胞及其他多种组织中的成骨细胞等。IGF-1能够与胰岛素受体结合，触发细胞内信号通路，从而激活或抑制细胞的增殖活动，参与调节代谢和生长发育等生命活动[24]。IGF-1基因在牛的生长、发育、代谢和泌乳中发挥重要的生理作用[25],同时它也可用于标记辅助选择[26]。宋林锦等[27]研究发现，IGF-1基因在关岭牛肝脏中相对表达量最高，并显著高于心脏、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌等12个器官/组织，与本研究结果相似；常永芳等[28]研究发现，IGF-1基因在牦牛毛囊发育的生长期、退行期和休止期均有表达，生长期和退行期的表达量显著高于休止期。以上研究结果表明，IGF-1基因不仅能促进动物生长，还能对动物肌肉、毛囊等多种生长性能产生影响，提示其可作为牦牛的分子标记进行深入研究。本研究中，IGF-1基因在肝脏中的相对表达量最高，这可能与IGF-1由肝细胞分泌[29]有关，说明IGF-1基因在不同肌肉组织中的表达水平随年龄增加呈降低的趋势，与韦云芳[30]的研究结果相近，也与M. Orita等[31]研究发现的GH基因和IGF-1基因具有促进肌肉生长和调控发育的作用相近。本研究结果也再次验证了它们对控制生长发育的主效基因有连锁作用的结论。IGF-1基因在2.5岁牦牛群体股肌中的相对表达量远高于其他3个年龄段，可能与IGF-1基因能够刺激软骨细胞的增殖和代谢，与特定时期骨骼的发育和生长有关[32]。

5、结论

在牦牛5种不同组织中，GH基因主要在0.5岁和1.5岁的幼龄阶段表达，且在肝脏、股肌和心脏中的相对表达量较高。IGF-1基因主要在幼龄阶段表达，随年龄的增加表达水平明显呈下降趋势，0.5～3.5岁时，在肝脏中均呈现高表达。GH基因和IGF-1基因在不同组织中的表达水平随年龄增高而降低的趋势基本一致。后期可以进一步利用高通量测序、基因组编辑及重组蛋白等现代生物技术对GH、IGF-1基因在牦牛不同年龄阶段及不同器官/组织表达情况进行功能性研究，以期缩短育种周期，改良牦牛品种遗传特性，为研究牦牛生长发育的遗传分子机制提供参考。

参考文献:

[1]钟金城,赵素君,陈智华,等.牦牛品种的遗传多样性及其分类研究[J].中国农业科学,2006,39(2):389-397.

[2]马志杰,钟金城,陈智华,等.牦牛DNA分子遗传标记的研究[J].中国牛业科学,2006,32(1):43-48.

[4]张艳丽,容维中,徐建峰,等.早胜牛GH基因多态性与其生长发育性状的相关性分析[J].中国牛业科学,2016,42(4):13-17.

[8]海汀,柴志欣,钟金城.麦洼牦牛GH､GHR､GHSR基因的SNPs检测及其与体尺性状的关联分析[J].畜牧兽医学报,2017,48(4):605-617.

[10]冉雪琴,李景,王嘉福.贵州香猪IGF1基因的克隆及组织分布[J].山地农业生物学报,2009,28(1):41-45.

[11]宋海燕,苏少锋,王希生,等.GH､IGF1及其受体基因在蒙古马不同器官中的表达差异[J].农业生物技术学报,2018,26(4):670-678.

[14]魏振.甲壳动物生长发育的激素调控研究概述[J].安徽农业科学,2012,40(16):8899-8900,8925.

[15]刘丽丽.胰岛素样生长因子I的研究进展[J].中国草食动物科学,2013,33(6):57-59.

[20]闫云峰,杨华,杨永林,等.萨福克羊GH和IGF-1基因组织表达水平的分析[J].家畜生态学报,2014,35(4):18-22,28.

[22]傅芳,王利,字向东.麦洼牦牛不同生长阶段肝脏差异表达基因分析[J].兽类学报,2022,42(1):85-94.

[23]潘和平,姚玉妮,梁春年,等.大通牦牛IGF-Ⅰ基因多态性及其与生长性能相关性的研究[J].甘肃农业大学学报,2008,43(6):33-37.

[27]宋林锦,许厚强,李永,等.关岭牛IGF1基因干扰载体构建及其对成肌细胞的影响[J].农业生物技术学报,2022,30(5):896-907.

[28]常永芳,包鹏甲,张永峰,等.天祝白牦牛IGF-1基因克隆､生物信息学及差异表达分析[J].西北农业学报,2019,28(12):1934-1941.

[30]韦云芳,李飞翔,汪斌,等.昆明犬IGF1基因在肝脏中的表达特征及遗传多样性分析[J].黑龙江畜牧兽医,2024(4):108-114.

基金资助:四川省科技计划重点研发项目(2022YFN0037); 青海省重大科技专项(2021-NK-A5); 国家肉牛牦牛产业技术体系项目(CARS-37);

文章来源:杨博璇,罗晓林,赵彦玲,等.GH基因和IGF-1基因在不同年龄牦牛器官/组织中表达的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2024,(21):114-118.